干货来啦！AAV感染小鼠肠道及注射剂量指南

近期，小编接触到很多老师咨询肠道方向的AAV的注射方式，本期我们将对肠道的病毒感染方式及AAV参考剂量进行总结。

首先，我们了解一下肠道系统的结构，小肠全长约4-6米，分为十二指肠、空肠和回肠三部分；上连胃幽门，下接盲肠随后连接大肠（包括盲肠含阑尾、升结肠、结肠右曲、横结肠、结肠左区、降结肠、乙状结肠、直肠）。

常见感染肠道的注射方式主要分为4种，分别为尾静脉注射、腹腔注射、灌肠和肠系膜动脉注射^[1，2]。其中系统性的递送途径包括尾静脉注射和腹腔注射，这两种注射方式操作简单，但不具有特异性，除了肠道其他组织器官也有可能感染，同时病毒的损耗也会比较大：

尾静脉注射是常见的的系统性注射方式，通过这种方式可以感染全身的大多数器官，它的优点是操作简便，对动物的损伤较小，缺点是无法实现特异性感染，尤其是肝脏、血管等更易感。

具体步骤如下（来源于吉凯平台）：

尾静脉注射示意图（图片来源于吉凯）

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 离心管）、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化）、生理盐水或 PBS。

2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚；

b. 然后将小鼠装入固定器 ( 可用 50ml 离心管改造）中，盖紧盖子，并使其尾巴朝外露出；

c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管扩张 ( 也可用热水、加热器等）。

3. 病毒注射

a. 用生理盐水或 PBS 将病毒稀释至合适滴度 ( 控制病毒注射体积在100-200μl）；

b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒；

c. 将小鼠尾巴拉直使其红色静脉清晰可见，在距尾尖 1/3 处进针，缓慢注入病毒后拔出，用棉球按压注射点 1min 左右以止血。

4. 动物恢复

将小鼠从固定器上取下，放回原饲养笼中。

腹腔注射的方式适用于脂肪、肌肉、胰腺、肠道等全身器官，以及新生鼠（造成的损伤较小），通过这种递送途径，肠道的平滑肌及浆膜感染概率更大，可以观测到散在的GFP染色，但是上皮细胞感染的概率较小。

具体步骤如下（来源于吉凯平台）：

腹腔注射示意图（图片来源于吉凯）

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、1ml 注射器。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取适量病毒，置于冰上备用。

2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚；

b. 然后左手握小鼠，用拇指和食指捏住小鼠颈背部，用无名指及小指固定其尾和后肢，确保小鼠躯体舒展且不能乱动。

3. 病毒注射

a. 右手取吸好病毒的注射器，翻转左手使小鼠头部朝下且腹部完全暴露给操作者；

b. 手持注射器在下腹部离腹白线约 0.5cm 处下针，使针头与小鼠腹部约成 30°夹角刺入腹部，刺入过程中如感觉到抵抗力突然消失，表明针头已进入腹腔，此时调整针头方向约与小鼠腹部平行，缓缓进针；

c. 针头进入适当距离后，匀速注射病毒液后，缓缓拔出针头 ( 旋转针头以避免漏液）。

4. 动物复苏

将小鼠放回原饲养笼中，注意观察小鼠状态。

除了系统性的递送方式外也可通过局部注射的方式实现AAV的递送，肠道方向包括灌肠和肠系膜动脉注射的方式，优点是病毒剂量更小、可以直接感染需求部位，但同时也具备一定的缺点，那就是对动物造成的损伤更大。

有文献报道通过灌肠的方式感染肠道组织，由于需要通过小鼠肛门插管进行灌肠，因此感染深度具有一定的局限性，感染结肠的概率更大，一般小鼠剂量推荐4E10vg/只以上，体积200μl。

具体步骤如下（来源于参考文献^[1,3,4]）：

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、聚乙烯导管。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取适量病毒，置于冰上备用。

2. 病毒注射

a．首先使用异氟醚麻醉小鼠；

b．然后将聚乙烯软管插入距离离肛门4厘米深的小鼠结肠部位，使用注射器缓慢注入适量的病毒；

c．注射完毕后，将小鼠在垂直倒立状态保持1分钟以上，以确保病毒在结肠部位的均匀分布；

d. 待小鼠复苏后可以恢复正常饮水及饮食。

肠系膜动脉是分布于消化管的动脉，主要分为肠系膜上动脉和肠系膜下动脉，结合小肠结构图来看，肠系膜上动脉分布于小肠左侧，肠系膜下动脉分布于结肠、大肠及泄殖腔部位，因此通过该方法可以感染小肠及结肠部位的细胞。

具体方法如下（来源于参考文献^[1,2,5]）：

a.  保定完成后使用异氟醚麻醉小鼠；

b.  通过左上方的皮肤进行1-2 cm的穿刺沿着腋线和侧腹的脾脏区域。切开腹外斜肌暴露SMA（肠系膜动脉）。使用微型牵开器将皮肤和腹壁固定，并用温暖的盐水纱布覆盖小肠防止回缩；

c.  使用微血管放大器在放大20倍的情况下，将SMA轻轻地从腹膜后剥离，在近端伤口周围放置连接注射针，使用一个微型血管钳暂时夹闭血管腹主动脉；

d. 将定制33号1/2‘’英寸点式2型进样针（Hamilton; Reno, NV)）连接250 μl汉密尔顿TLL气密性进样针注射器插入肠系膜动脉，轻轻结扎血管保持稳定防止注射泄漏，随后进行病毒注射；

e.  注射结束后取下注射器械，解除夹闭，使血液流回肠道组织。

肠系膜动脉注射示意图

最后，小编对肠道系统的AAV注射方法及剂量进行总结，大家可以根据自己需求进行选择预实验的参考剂量，设置梯度，选择最佳剂量：

 肠道系统AAV感染范围及剂量参考

【参考文献】

[1] Polyak S , Mah C , Porvasnik S , et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5.[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2008, 53(5):1261-1270.

[2] Steven P , Annette M , Stacy P , et al. Identification of adeno-associated viral vectors suitable for intestinal gene delivery and modulation of experimental colitis[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology, 2012, 302(3):296-308.

[3] Zheng X , Lv Y , Li S , et al. Adeno‐associated virus‐mediated colonic secretory expression of HMGB1 A box attenuates experimental colitis in mice[J]. Journal of Gene Medicine, 2016.

[4] Zheng X Y , Lv Y F , Li S , et al. Recombinant adeno-associated virus carrying thymosin β4 suppresses experimental colitis in mice[J]. World Journal of Gastroenterology, 2017, 23(2):242.
[5] Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Targeting murine small bowel and colon through selective superior mesenteric artery injection[J]. Microsurgery, 2010, 30(6):487-493.