Nature子刊：转录组+蛋白质组全面揭示缺氧诱导因子在肿瘤发生中的调节作用

VHL突变失活是大多数透明细胞肾细胞癌（ccRCC）最早发生的遗传事件，会导致缺氧诱导因子-1α（Hif1α）和缺氧诱导因子-2α（Hif2α）的积累。当前的功能研究表明，Hif1α可抑制肿瘤侵袭，而Hif2α则发挥促进作用，但它们在肿瘤发病中的作用尚未得到充分研究。

德国弗莱堡大学研究团队在《Nature Communications》（IF:14.919，中科院JCR 1区）上发表了题为“Hif1α and Hif2α differently regulate tumour development and inflammation of clear cell renal cell carcinoma in mice”的研究论文。研究揭示了HIF-1α在肾透明细胞癌中的致癌作用，且HIF-1α和HIF-2α二者活性平衡的改变会影响ccRCC的生物学差异和疾病侵袭性。

von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制基因的双等位基因失活是大多数透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中重要的遗传事件，一些核心表观遗传调控基因(包括PBRM1、BAP1、SETD2和KDM5C)、细胞周期调控基因(包括TP53、CDKN2A和MYC)或PI3K途径基因(包括PIK3CA、PTEN、MTOR和TSC1)的突变或染色体拷贝数改变被认为与VHL失活合作，共同促进ccRCC肿瘤的进展。许多小鼠模型支持这种基因合作的观点。为了研究Hif1α和Hif2α在ccRCC发展中的作用，使用了一种基于他莫昔芬诱导的肾上皮细胞特异性缺失(Ksp-CreERT2)  Vhl、Trp53和Rb1的ccRCC小鼠模型（该模型部分反映了再现了人类ccRCC进展的很多特征）来研究Hif1α和Hif2α在ccRCC中的作用。

作者先获得了不同基因缺失的小鼠模型：

（1）Vhl^fl/fl; Trp53^fl/fl; Rb1^fl/fl (正文中记作 VhlΔ/ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/Δ，图中记作 VpR ）

（2）Vhl^fl/fl; Trp53^fl/fl; Rb1^fl/fl; Hif1α^fl/fl(正文中记作VhlΔ/ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/ΔHif1αΔ/Δ，图中记作VpRH1 )

（3）Vhl^fl/fl; Trp53^fl/fl; Rb1^fl/fl;Hif2α^fl/fl (正文中记作VhlΔ/ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/ΔHif2αΔ/Δ，图中记作 VpRH2 )

（4）Trp53^fl/fl; Rb1^fl/fl (正文中记作ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/Δ，图中记作pR ）

检测了各模型小鼠的肿瘤形成情况，发现：在ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/Δ背景下，VHL缺失能促进肿瘤发生和生长。Hif1α缺失完全逆转了VHL缺失产生的促进肿瘤发生发展的作用。Hif2α缺失导致中等程度的肿瘤发生。以上几种基因型小鼠中均未发现肿瘤转移方面的变化。这些数据表明，Hif1α对于Vhl突变ccRCCs的有效进展和生长非常重要，而Hif2α仅是部分必需的。

作者先获得了各基因型小鼠的胚胎成纤维细胞，通过缺失Vhl或（和）Hif1α或（和）Hif2α后，检测细胞的增殖活力，结果表明，Vhl缺失会导致增殖能力的下降。而不同于其他研究结果，在永生化的Vhl^fl/flTrp53^fl/fl小鼠胚胎成纤维细胞研究结果中发现，增殖能力的缺失是Hif1α依赖性的，即在Vhl缺失的情况下，Hif1α扮演抑制细胞增殖的角色。

紧接着，作者从VhlΔ/ΔTrp53Δ/ΔRb1Δ/Δ小鼠中获取ccRCC细胞，并通过再表达pVHL或缺失Hif1α检测细胞的增殖能力。结果表明，再表达pVHL或Hif1α缺失均不会影响细胞的增殖，但能显著促进细胞的生长。同时，通过同种动物移植瘤模型确认，pVhl再表达能显著延迟肿瘤的生长，而Hif1α敲低则不会。

综合以上结果表明，Hif1α抑制VHL缺失的正常小鼠细胞的增殖，但不影响小鼠ccRCC细胞的增殖和同种移植瘤的形成，说明了原发肿瘤发生对Hif1α的特异性需求。这同时也表明，Hif1α只有在肾脏上皮的生理环境下才有明显的致癌作用。

作者对 WT 皮质样本、Vhl & Trp53 & Rb1共缺失肿瘤样本、Vhl & Trp53 & Rb1 &Hif1α共缺失肿瘤样本、Vhl & Trp53 & Rb1 &Hif2α共缺失肿瘤样本进行了RNA测序。PCA分析表明，WT样本和其他样本有明显的转录组差异。分析表明，HIF-1α能够调节糖酵解过程，而HIF-2α参与脂蛋白代谢相关基因的调控、核糖体生物发生以及E2F和MYC的转录活性。有趣的是，在Hif2α缺失的肿瘤组织中上调的基因包括那些与干扰素信号、T细胞活化、先天免疫、适应性免疫、抗原处理和呈递、NF-κB 相关的基因以及IRF转录因子靶基因，提示肿瘤的免疫环境发生了改变。

作者又进一步对 WT 皮质样本、Vhl & Trp53 & Rb1共缺失肿瘤样本、Vhl & Trp53 & Rb1 &Hif1α 共缺失肿瘤样本、Vhl & Trp53 & Rb1 &Hif2α共缺失肿瘤样本进行了蛋白质组学检测，共定量了4257个蛋白。总体的转录组和蛋白组比较显示了低的相关性。差异蛋白富集的结果和转录组相似，HIF1α缺失降低了糖酵解酶的表达，增加了与氧化磷酸化和呼吸电子转运相关的蛋白质的表达，而Hif2α缺失降低了MYC靶基因的表达，导致与免疫反应、干扰素信号、细胞因子信号和抗原呈递相关的基因表达增加。总之，蛋白质组与转录组为预测肿瘤基因型之间的生物学差异提供了独立的验证。

转录组和蛋白组的结果表明，Hif2α缺失的肿瘤模型小鼠中抗原呈递相关基因上调表达，如MHC I类和II类基因以及与抗原提呈相关的基因的高表达。作者通过分析TCGA mRNA测序的结果，确认Hif2α在肿瘤中的广泛表达。随后，作者通过皮尔森相关性分析发现，Hif2α和6个MHC I类基因中的3个、15个MHC I类基因中的12个以及51个非MHC类但属于抗原呈递相关基因中的26个呈负相关。综合以上小鼠模型的结果和人TCGA数据库的结果，作者认为Hif2α抑制抗原呈递。

比较了不统计基因型肿瘤中与炎症相关的不同免疫细胞的相对丰度或特异性基因特征。总的来说，三种基因型的肿瘤组织与WT皮质进行比较发现了与髓样细胞炎症相关的基因富集，包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，但不包括肥大细胞或嗜酸性粒细胞。研究结果表明，Hif1α和Hif2α都可能作为促进ccRCC肿瘤中血管形成的积极因素。总的来说，ccRCC肿瘤细胞中缺氧诱导因子基因的遗传拷贝数或表达水平状态与肿瘤微环境中先天和适应性免疫系统的组成和激活状态相关。

作者通过在 Vhl、Trp53和Rb1共缺失的ccRCC小鼠模型进一步敲除缺氧诱导因子1α（Hif1α）或缺氧诱导因子2α（Hif2α），通过检测肿瘤形成、生长等实验证明Hif1α对于肿瘤的形成是必不可少的，而Hif2α的缺失对肿瘤的发病和生长速度只有中等程度的影响。通过对不同基因型肿瘤的转录组学和蛋白组学研究，明确了Hif1α和Hif2α缺失造成的基因和蛋白变化以及对肿瘤免疫微环境的影响。总体，这项研究明确了缺氧诱导因子-1α和缺氧诱导因子-2α在肾细胞癌形成和发展中的不同作用，而他们的不同活性（缺失或增益）对肿瘤和肿瘤免疫有不同的影响，这将为肾细胞癌的治疗带来一些启发。