2021-08-19 07:26:02 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)
治疗性寡核苷酸的纯化及表征是目前制药行业的一大热点。然而,寡核苷酸的表征,特别是通过离子对反相液相色谱(IP-RPLC)进行表征,可能会非常具有挑战性。治疗性寡核苷酸是通过固相合成制造,也就是核苷酸以特定合成步骤进行循环。因此,我们必须对 n-1 和 n+1 等杂质进行表征,这其中可能需要大量的方法开发步骤来进行优化。此外,我们可能还需要对其他密切相关的杂质进行表征和定量,例如硫代磷酸酯的氧化。
另一个挑战是在寡核苷酸分析中可能会观察到的色谱的变化。保留时间、峰形和峰面积回收率可能在一个序列的进样之间变化。这些变化的一个可能原因是有会影响色谱性能的分子内相互作用。因此,我们通常会采用超过 60°C 的高温来改善分离。虽然这是处理双链寡核苷酸(如 siRNA)时的基本要求,但单链寡核苷酸是否也有必要在高温下分析是一个值得讨论的问题。在此技术笔记中,我们展示了温度对两种寡核苷酸,一种 5‘ 共轭寡核苷酸和一种硫代磷酸酯,的影响,以及如何将其用于单链寡核苷酸的方法开发过程。
图 1 说明了以 5°C 为增量增加方法运行温度的效果。和其他色谱方法类似, 5''-氨基 C12 寡核苷酸的保留时间随着温度升高而减少。通常,效率和峰形在更高的温度下会得到改善,但是在本示例中没有观察到这一点。此外,在比较 45°C 和 65°C 的杂质分布时,图中几乎没有显示出明显差异。因此,人们可能会得出结论,选择性没有受到温度的影响。
为了更好地确认选择性变化,需要使用质谱来识别和表征杂质峰。具有未知序列的 22 mer DNA 硫代磷酸酯通过高分辨率 MS 进行分析。硫代酸盐的测量质量为 6772.6 Da。我们在不同温度下进行寡核苷酸的分析,以观察杂质分析选择性的变化。
在比较 60 和 70°C 下运行的方法时(图 2),如预期所示,在较高运行温度下,主峰的保留显着降低。然而,两种方法都给出了相似的杂质谱。我们观察到了三种较早洗脱的杂质。解卷积质谱证实了相同的洗脱顺序。杂质峰1为6443.4 Da,峰2为6468.4 Da,峰3为6170.8 Da。两种运行条件下峰 1 的解卷积光谱如图 3 所示。有趣的是,峰 1 和 2 可能都是 n-1 杂质,峰 1 是目标序列减去鸟苷,峰 2 是目标序列减去胸苷。
总的来说
不同温度通常用于寡核苷酸分析的方法开发。然而,对于单链寡核苷酸,在超过 60 的温度下运行可能并没有太大提升。因为温度的升高可能不会改善色谱分离,也不会影响选择性,正如我们在其他大分子中观察到的一样。
液相色谱条件
色谱柱: bioZen™ 2.6 µm Oligo
规格: 100 x 2.1 mm (图 1)00D-4790-AN
150 x 2.1 mm (图 2,3)00F-4790-AN
流动相:图1:
A:12.5 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液
B:12.5 mM HFIP, 4 mM TEA甲醇溶液
图2,3:
A:100 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液
B:100 mM HFIP, 4 mM TEA 甲醇溶液
梯度: 5-30 % B 于14分钟内 (图1)
25-95% B于15分钟内(图2,3)
流速: 0.3 mL/min
进样量: 1uL
温度: 如图所示
检测器: UV@260nm(图1,2)
TOF-MS(图3)
样品: 5‘-氨基C12 寡核苷酸(图1)
DNA 22mer硫代磷酸酯(图2,3)
图1:温度对 5''-氨基 C12 寡核苷酸的影响
图2:22 mer DNA 硫代磷酸酯的杂质谱图
图3:杂质峰 1 的解卷积谱图
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