ADC抗体耦合药物的分析

针对抗体偶联药物及其酶解产物进行色谱分析能够获得偶联位点数目和位置、游离药物含量和药物抗体偶联比等重要信息。同时，色谱分离技术可以纯化不同组分用于进一步分析。

基于疏水（反向高效液相色谱ＲP-HPLC、疏水相互作用色谱HIC）、电荷（离子交换色谱IEC）和分子大小（分子排阻色谱SEC）原理进行分离的色谱技术已广泛用于分析抗体偶联药物。

其中，ＲP-HPLC可对不同药物载量的完整ADC药物、抗体轻重链以及游离药物进行分离和定量。反向高效液相色谱柱采用烷基链共价结合到非极性固相表面，在高柱温（60～80℃）条件下实现完整抗体蛋白的高分辨率分离。此外，该方法还被用来检测不同ADC药物中游离药物的水平；采用反向高效液相-质谱联用技术检测释放到血浆中和体外培养肿瘤细胞中的游离药物。然而，这一技术的挑战是高柱温和有机流动相无法使ADC药物维持天然结构。

疏水相互作用色谱HIC是另一种用于分析抗体偶联药物的色谱分离技术，和ＲP-HPLC一样，HIC也是根据疏水性不同进行分离。不同的固定相（苯基、丁酰基、己基等）具有不同的疏水性和选择特性。通常采用高盐浓度流动相使蛋白结合到固定相，继而降低盐浓度进行洗脱。这种温和的结合与洗脱条件保持了偶联抗体的天然构象，因此该技术也可以用于纯化完整抗体偶联药物。

其他色谱方法如离子交换色谱法被用于评价异质性和抗体偶联药物的药物分布，分子排阻色谱法被用于评价抗体偶联药物的聚集、污染物的去除、降解情况、药物分布以及热稳定性等。

免疫检测法包括检测抗体偶联药物对靶蛋白的结合；ADC药物、抗体以及药物的定量分析；评价接头与药物的稳定性；检测与FcγＲ的结合以及免疫原性评价。这些检测对于理解抗体偶联药物的效价、药代动力学和安全性具有重要意义。其中，酶联免疫吸附测定法常被用来评价抗体偶联药物的浓度以及与抗原的结合。

用于抗体偶联药物分析的ELISA种类包括总抗体ELISA、半均质ELISA、竞争性ELISA和偶联抗体ELISA等。特异性总抗体ELISA是指在孔板上包被靶抗原或抗独特型抗体，采用酶联种属特异的抗免疫球蛋白二抗来检测ADC与包被抗原的结合。采用半均质ELISA时，捕获抗体和检测抗体在固定到孔板之前与抗体偶联药物形成复合物，在分析不同药物载量的抗体偶联药物时表现出明显优势。

对于竞争性ELISA，首先包被捕获分子（靶抗原或抗药抗体）在孔板上，用于结合固定量标记试剂（即标记的ADC或游离药物）。将ADC或游离药物的标准物质或样品（竞争物）与固定量的标记试剂预孵育。将整个混合物加入到上述预包被的孔板中，清洗并检测。样品（ADC药物或游离药物）浓度越高，检测信号越弱，该方法更适合检测游离药物含量。偶联抗体ELISA是通过抗药抗体来捕获ADC药物的药物部分，同时联合使用抗独特型抗体或抗人IgG抗体，仅检测偶联有药物的抗体，而不检测未偶联的抗体。偶联药物抗体的定量对于体内效价实验，尤其是药物暴露、药代动力学和药效动力学具有重要意义。药物抗体偶联比DAＲ可用来作为评价接头稳定性的通用指标。

免疫检测法所面临的挑战包括：进入循环系统后，抗体偶联药物中的药物释放，导致抗体偶联药物DAＲ发生改变。另外药物与抗体的偶联本身可能影响ADC药物与捕获试剂或检测试剂的结合。对于偶联抗体ELISA，当采用抗药抗体作为捕获剂时，可能无法均匀地测定不同药物载量的ADC药物，而采用抗药抗体作为检测试剂，则可能无法获得与药物分子数目成比例的检测信号。

质谱技术可用于评价接头的稳定性，分析游离药物、代谢物、不同DAＲ组分和相对比例等。通过液质联用（LC/MS）分析技术实现抗体偶联药物（ADC）的结构表征和特性分析，评价ADC药物接头的稳定性，分析DAＲ和偶联位点，测定不同DAＲ组分的相对比例等。

质谱检测技术的挑战之一是无论药物载量的高低，都假定所有物质同未偶联抗体具有相同的离子化效率。因此，应用质谱技术分析DAＲ的前提是假定所有物质具有相同的回收率和电离情况。而实际情况并非总是如此，因为药物与带正电的胺的偶联将导致所带电荷和疏水程度的改变。因此，在进行方法开发的过程中，评价所有的成分是否发生相似的电离很重要。此外，易水解的接头（例如含有腙的接头）可能受酸性的液质条件或激光基质辅助激光解吸/电离质谱分析中常采用的酸性基质的影响，导致获得与实际情况不相符的DAＲ。

紫外-可见分光光度法用于检测ADC药物的杂质、DAＲ以及抗体偶联药物的浓度。利用单克隆抗体和偶联药物的最大吸光值及消光系数，可以计算出单抗和药物各自的浓度。

紫外-可见分光光度法需要药物与未偶联抗体的紫外/可见光光谱具有不同的最大吸光波长。另一个挑战是药物的消光系数或最大吸光度在偶联前后或不同的缓冲液中可能发生改变。