项目文章 | 浙大二院郑树/胡望雄团队揭示HOXC6促进右半结肠癌转移机制

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2021年4月，浙江大学医学院附属第二医院郑树、胡望雄课题组在《Cell Death & Disease》期刊发表了题为“HomeoboxC6 promotes metastasis by orchestrating the DKK1/Wnt/β-catenin axis in right-sided colon cancer”的研究成果，该研究利用癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合（GEO）数据库的表达数据集揭示HOXC6在右半结肠癌（RCC）中的潜在致癌作用，并用小鼠模型评估肿瘤细胞在体外和体内的增殖，迁移和侵袭能力，还研究了HOXC6通过DKK1/Wnt/β-catenin轴促进RCC转移机制，为RCC治疗中分子靶点的研究提供参考。

结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率与死亡率排第三的恶性肿瘤。临床发现，右半结肠癌（RCC）患者的预后比左半结肠癌（LCC）患者明显差。对左右半结肠癌的分子差异方面进行研究，发现与LCC相比，HOXC6是RCC中上调最显著的基因。有诸多研究表明HOXC6在各种癌症如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，白血病等中均被上调并起着至关重要的作用，然而目前有关HOXC6在CRC中作用的具体机制尚不清楚。

大肠癌的治疗方法除手术、放疗、化疗及靶向治疗之外，免疫治疗已经进入大肠癌领域。免疫微环境中成分复杂，虽已有研究表明M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、辅助性T细胞以及肿瘤相关成纤维细胞均有促进肿瘤的作用，M1型TAM、CD8+T细胞及NK细胞具杀伤肿瘤的作用，但对肿瘤微环境（TME）的了解仍然有待进一步研究，对揭示造成肿瘤免疫逃逸的原因以及开发新的免疫治疗靶点至关重要。

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1.HOXC6在RCC中过表达，及其与不良预后的相关性

TCGA数据库分析结果提示在mRNA水平，HOXC6的表达在CRC中较正常组织无明显上调（P = 0.1935，图1 A），但对肠癌进行位置分层（RCC和LCC）后发现，HOXC6在RCC中显著上调（P < 2.2e-16，图1 B），但在LCC中仍然无明显上调。随后，用6对配对肠癌及癌旁组织标本（3对RCC，3对LCC）提取蛋白进行差异表达验证，结果表明HOXC6在RCC中较癌旁组织上调，但在LCC中无上调（图1 C），与TCGA数据库分析所得的结果一致。

用TCGA数据库进行预后分析发现，在RCC中HOXC6高表达组预后显著较低（Log rank P = 0.0126，图1 D），但在LCC中HOXC6高表达无预后意义（Log rank P = 0.957，图1 E）。为了独立验证HOXC6在肠细胞癌中的预后作用，从浙江大学医学院中收集的100例RCC样本的TMA用于IHC评估，结果验证了HOXC6高表达预后差的结果（Log rank P = 0.003，图1 F，G）。

图1 | HOXC6在RCC中过表达，及其与不良预后的相关性

2.HOXC6过表达促进肠癌细胞的迁移及侵袭

作者利用体外的细胞实验以及体内的裸鼠模型实验来探究HOXC6与肠癌细胞增殖以及转移能力的关系。为挑选合适的细胞系进行实验，首先在六种肠癌细胞中分析HOXC6的蛋白表达水平，挑选表达相对最高和最低的细胞系，其中RKO的表达水平最高，HCT116的表达水平最低（图2 A）。于是用这两种细胞系转染过表达慢病毒构建HOXC6过表达稳转细胞系（HCT116-OE）以及用siRNA构建HOXC6敲低瞬转细胞系（HOXC6-KD）（图2 B，C）。得到工具细胞后，评估HOXC6表达水平变化后HCT116和RKO细胞增殖能力的影响。结果显示，HOXC6过表达或敲低后不影响HCT116和RKO细胞在体外的增殖速度（图2 D，E）。小鼠皮下注射稳定的HOXC6-OE和HOXC6-KD HCT116细胞，在其体内形成肿瘤，发现HOXC6不改变肿瘤细胞增殖(图2 F–K)。

图2 | HOXC6在体内外均不改变肿瘤细胞的增殖能力

评估肿瘤细胞在体外的侵袭、迁移和转移效果时，发现HOXC6-OE组的侵袭和迁移能力显著增强，而当HCT116（图3 A-C）和RKO细胞系（图3 D-F）中HOXC6下调时，其侵袭和迁移能力显著受阻。体内实验中，用尾静脉注射肿瘤细胞的转移瘤模型评估HOXC6过表达后形成转移灶的能力，在鼠肝中未发现转移瘤形成，而在鼠肺中发现有转移瘤形成（图3 G）。HOXC6-OE组的转移数量大于NC组（图3 H，I）。HE染色也显示HOXC6-OE组转移灶的大小更大（图3 J）。

图3 | HOXC6过表达促进肠癌细胞的迁移及侵袭

3.MLH1沉默与HOXC6的过表达有关

为了解开HOXC6在RCC中比LCC表达高得多的原因，比较了HOXC6与TCGA中其他所有检测到的 20501个基因表达的相关系数，发现MLH1的表达与HOXC6呈显著负相关(P=1.4E −09, cor=−0.37, 图4 A)。为明确这两者之间的表达关系，利用siRNA将HT29以及Sw620细胞系中的MLH1表达水平敲低，在mRNA水平，HOXC6的表达水平在HT29中上升1.3倍(P < 0.05，图4 C)，在Sw620中上升1.7倍（P < 0.001，图4 D），推测MLH1的沉默可以导致HOXC6过表达。

图4 | MLH1沉默与HOXC6的过表达有关

4.HOXC6有助于Wnt/β-catenin通路和EMT的激活

了解HOXC6如何促进肿瘤细胞转移的详细机制可以阐明HOXC6的高表达与RCC侵袭性之间的关联。因此，作者首先对HOXC6-OE组和NC组进行了RNAseq，发现Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1在HOXC6-OE细胞中上调了13.8倍。随后采用Co-IP和LC-MS/MS（蛋白质质谱鉴定）发现DKK1可以与HOXC6结合。还发现HOXC6的表达与AXIN2（图5 A）和 RNF43（图5 B）显著负相关，其中AXIN2和RNF43为已知的Wnt/β-catenin通路的抑制因子，可加速β-catenin的降解。这些结果表明HOXC6与RCC中Wnt/β-catenin通路的激活密切相关。

为了进一步阐明HOXC6与Wnt/β-catenin通路的关系，作者采用WB实验评估Wnt通路经典分子β-catenin的表达，β-catenin总的表达水平上调或入核增多是Wnt信号通路被激活的标志。结果显示，HOXC6-OE组的总β-catenin和细胞核β-catenin升高，而siHOXC6组则降低（图5 C，D）。Wnt/β-catenin通路的下游靶标c-Jun的表达与β-catenin的表达趋势一致（图5 C，D）。此外，RNF43和Axin2与β-catenin呈负相关表达趋势（图5 C）。为更好地了解与HOXC6高表达相关的分子通路，进行GSEA分析。结果显示EMT（NES=1.71，P=0.038，图5 E）是HOXC6过表达的特征。上调vimentin和snail可导致HOXC6在HCT116细胞中过表达，而敲低HOXC6的表达后可使肿瘤细胞发生MET（图5 F）。

图5 | HOXC6有助于Wnt/β-catenin通路和EMT的激活

5.HOXC6通过抑制DKK1分泌激活Wnt/β-catenin通路

为了探究HOXC6促进DKK1表达和DKK1上调导致Wnt/β-catenin途径的激活机制，作者首先通过qPCR和WB实验验证高通量RNA测序结果，发现DKK1的表达在HOXC6-OE组显著上调，在HOXC6-KD组显著降低（P< 0.05，图5 C，G）。又采用Co-IP和WB实验表明DKK1能够与HOXC6结合，但β-catenin不能（图6 A）。为了排除DKK1和HOXC6裂解后相互作用的可能性，作者还进行了荧光共定位实验，发现在293 T和HCT116细胞中定位到了部分HOXC6和DKK1，证明HOXC6可以直接与DKK1结合（图6 B，C）。因HOXC6具转录因子功能，因此进行双荧光素酶基因报告检测实验，但结果显示HOXC6不能直接与该序列结合从而促进DKK1的转录（图6 D）。故假设DKK1在细胞内表达的升高因其外分泌受抑制，实验结果显示HOXC6可通过在胞内与DKK1结合抑制其外分泌从而在细胞质中上调DKK1的表达（P< 0.001，图6 E，5D），与假设一致。HOXC6 过表达可抑制DKK1的外分泌从而降低其对Wnt/β-catenin通路的抑制，Wnt/β-catenin通路被相对激活（图6 F）。

因为EMT与转移密切相关，于是作者评估了HOXC6是否通过DKK1/Wnt/β-catenin调控轴促进 EMT。Transwell实验表明，敲低β-catenin或DKK1显著抑制了HCT116细胞的迁移（P<0.001，图6 G，H）。应用HCT116细胞进行实验，用siRNA在HOXC6过表达的基础上敲低DKK1或β-catenin的表达，在蛋白层面，与siCtrl相比ZO-1和E-cadherin上皮标志物表达上调，vimentin和snail间质标志物表达下调，表明EMT发生（图6 I）。以上结果表明，HOXC6/DKK1/β-catenin调控轴可促进EMT发生。

图6 | HOXC6通过抑制DKK1分泌激活Wnt/β-catenin通路

6. 沉默HOXC6是一种有前景的RCC治疗策略

鉴于EMT与HOXC6密切相关，于是作者评估了HOXC6敲除是否是RCC治疗的可行策略。首先用5-FU、伊立替康和奥沙利铂这三种CRC常用药来测试HOXC6对药物敏感性的影响，5-FU、伊立替康和奥沙利铂在HCT116细胞中的48小时IC50值分别是3.125 µg/ml、32和100µM（图4 E-G），在HT29细胞中是1.5625、100和12.5µM（图4 H–J）。药敏试验表明，敲低HOXC6使HCT116细胞对5-FU（P<0.01）、伊立替康（P<0.001）、5-FU+伊立替康和5-FU+伊立替康+奥沙利铂更敏感（P<0.001，图7 A）。在HT29细胞系中，也观察到类似的结果，HOXC6的敲低使肿瘤细胞对伊立替康（P<0.01）、5FU+伊立替康（P<0.01）和5-FU+伊立替康+奥沙利铂更敏感（P<0.05图7 B）。

图7 | 沉默HOXC6是一种有前景的RCC治疗策略

本研究发现在RCC中HOXC6过表达的肿瘤细胞与M2巨噬细胞间的正反馈相互作用导致肿瘤细胞发生EMT，肿瘤细胞内IL6/HOXC6/DKK1/β-catenin轴可促进EMT，最终导致RCC的转移和不良预后。HOXC6是RCC治疗中有潜在意义的分子靶点，值得进一步研究。

作者通过TCGA和GEO数据库的表达数据集揭示HOXC6在RCC中的潜在致癌作用。CCK8、transwell和尾静脉肿瘤细胞注射转移小鼠模型用于评估肿瘤细胞在体外和体内的增殖，迁移和侵袭能力。免疫组织化学和免疫荧光评估HOXC6表达和M2巨噬细胞浸润的相关性。蛋白质免疫印迹，qPCR，ELISA，Co-IP和荧光素酶基因报告检测来研究HOXC6与（EMT）的关系。最后用5-FU、伊立替康和奥沙利铂测试了HOXC6对药物敏感性。

参考文献：

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叮当 撰文

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