SCI ADV | 恭喜上海同济大学医学院贾鑫明团队肠道炎症分子机制研究发表中科院分区TOP期刊

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2021年5月，上海同济大学医学院贾鑫明教授课题组在《Science Advances》期刊发表了题为“E3 ligase c-Cbl regulates intestinal inflammation through suppressing fungi-induced noncanonical NF-κB activation”的研究成果，该研究通过建立葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型，探讨了c-Cbl在调节肠道炎症中的作用，研究了调节c-Cbl/ RelB轴响应真菌诱导的肠道炎症的具体分子机制，为炎症性肠病（IBD）的有效治疗提供了理论依据。

肠道微生物区系由细菌、真菌和病毒组成。近年来，肠道真菌（比如白色念珠菌和热带假丝酵母）在免疫相关疾病，或炎症性肠病（IBD）等肠道疾病的发病机制中的作用受到越来越多的关注。当受到外界真菌感染，机体可以通过模式识别受体，识别病原微生物的重要成分，激活相应的信号转导通路，最终诱导一系列炎性因子及干扰素的表达和分泌，引发炎症反应，启动适应性免疫应答。

CARD9是C型凝集素受体（CLR）通路下游的重要接头蛋白，Dectin-1、Dectin-2和Dectin-3作为模式识别受体属于CLR家族，可通过识别病原体细胞壁的高甘露糖结构域，从而促进抗真菌的获得性免疫。通常情况下，机体通过CARD9激活经典的NF-κB（p65）信号通路，活化Th17和Th1细胞介导的适应性免疫应答发挥抗真菌感染。尽管CLR/CARD9轴参与了对肠道真菌的识别和免疫，但调节微生物区系的免疫反应以维持肠道内环境平衡的机制仍不清楚。

c-Cbl 是一种E3泛素连接酶，可通过介导受体的泛素化和降解、受体偶联酪氨酸激酶（SYK）以及Wnt/β-catenin信号通路从而参与免疫调节。C-Cbl还可通过Toll样受体（TLR）刺激后负向调控IL-12的产生，在树突状细胞（DC）功能调节中发挥关键作用。研究表明，c-Cb1缺乏降低了p50和p105水平，而这两个水平已被证明可以调节NF-κB的刺激功能。然而，目前尚不清楚c-Cbl是否参与了CLR介导的NF-κB信号的调节或粘膜对肠道真菌的免疫。

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1.DC特异性c-Cbl缺乏使小鼠易患DSS诱导的结肠炎

为了确定c-Cbl是否与炎症性肠病（IBD）的发生相关，作者对克罗恩病（CD）或溃疡性结肠炎（UC）患者结肠镜活检中的c-Cbl的表达进行了生物信息学分析，发现CD和UC患者的c-Cbl指标显著低于对照样本（图1A）。此外，作者发现c-Cbl在DC中的表达显著高于从幼龄小鼠分离的巨噬细胞、T细胞、B细胞和肠上皮细胞中的表达，并且在DSS诱导的结肠炎中c-Cbl在DC细胞中的表达水平显著降低（图1B）。通过对c-Cbl^f/f和c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+（DC特异性缺乏c-Cbl）小鼠饲喂注入DSS（2.5%）的饮用水，发现C-Cbl^f/fCD11^Cre/+小鼠相比c-Cbl^f/f对照小鼠体重明显减轻，结肠长度减短，并患有更严重的结肠炎症（图1C-E）。

作者进一步探讨了DC特异性c-Cbl缺乏对经DSS处理后的小鼠结肠固有层（CLP）和肠系膜淋巴结（MLN）中固有免疫细胞和适应性免疫细胞的影响。研究发现DSS处理显著增加了c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠的CLP和MLN中中性粒细胞的百分比（图1F）。然而，c-Cbl^f/f和c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠的CLP和MLN中并未观察到巨噬细胞和树突状细胞百分比的差异（图1F）。此外，作者发现c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠产生IL-17A的T辅助17（TH17）细胞的频率更高，但与经DSS处理后的对照同窝小鼠相比，MLN中产生干扰素-γ（IFN-γ）的TH1细胞的频率并没有显著差异（图1G）。

结果表明，DC特异性c-Cbl缺失使小鼠更易患DSS诱导的结肠炎，其特征是TH17细胞分化增加和结肠中性粒细胞浸润。

图1 | 树突状细胞c-Cbl缺乏使小鼠易患DSS诱导的结肠炎

2.真菌来源的α-甘露聚糖诱导Dectin-2/3介导的c-Cbl激活以控制小鼠对结肠炎的易感性

作者观察到α-甘露聚糖刺激显著诱导c-Cbl磷酸化（图2A和B），BMDC中Dectin-2或Dectin-3的缺失完全阻断了α-甘露聚糖诱导的c-Cbl磷酸化（图2A和B）。此外，用Syk抑制剂处理骨髓来源的树突状细胞（BMDC）或人外周血单核细胞（PBMC）会显著减弱α-甘露聚糖诱导的c-Cbl磷酸化（图2C和D）。结果表明，Dectin-2/3-Syk信号传导对于α-甘露聚糖诱导的DC中c-Cbl的磷酸化至关重要。

研究发现，经DSS处理后，c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠结肠中的真菌负荷高于c-Cbl^f/f小鼠（图2E）。为了评估肠道真菌失调是否促进c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+ 小鼠结肠炎的发展，作者使用抗真菌药物氟康唑处理c-Cbl^f/f和c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠。根据之前的报道，氟康唑处理显著降低了结肠中的真菌负荷（图2E）。然而，在c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠中，肠道真菌的消耗显著减轻了结肠炎的严重程度，其特征是体重减轻的程度减小、结肠长度较长，结肠炎症状减轻（图2 F-H）。结果表明肠道真菌诱导的c-Cbl激活促进了小鼠对DSS诱导的结肠炎的抵抗力。

图2 | 真菌来源的α-mannans诱导Dectin-2/3介导的c-Cbl磷酸化，以控制小鼠对结肠炎的易感性

3.DC特异性c-Cbl缺乏会损害α-甘露聚糖诱导的IL-10产生

为了探讨c-Cbl介导的免疫保护机制，作者用α-甘露聚糖刺激野生型和c-Cbl缺陷型BMDC 3小时，然后进行了基因芯片。KEGG和GO分析显示，筛选得到的649个差异表达基因（DEG）分别与IBD和免疫相关过程（包括炎症反应）高度相关（图A和B）。与野生型BMDC相比，经α-甘露聚糖刺激后，c-Cbl缺陷型BMDC的il-10（IBD相关抗炎细胞因子的基因）表达较低（图3A），这一结果通过定量实时聚合酶链反应（PCR）得到了验证（图3B）。直接离体测定证实，经α-甘露聚糖刺激后，c-Cbl缺乏显著降低了BMDC中IL-10的产生（图3C）。研究还发现，在用白色念珠菌酵母或菌丝、热带念珠菌酵母或从白色念珠菌提取的甘露聚糖刺激后，c-Cbl缺乏显著降低了BMDCs中IL-10的产生（图3D）。

然而，c-Cbl缺乏对α-甘露聚糖诱导的BMDC或MLN中树突状细胞中趋化因子（cxcl1、ccl3、ccl5、ccl21和ccl8）和促炎细胞因子基因（il6、tnfα和il23）的表达没有影响（图3B、C和D)。值得注意的是，α-甘露聚糖刺激后，c-Cbl缺乏导致BMDC中IL-12p40的表达和产生显著降低（图3B和C）。研究表明，在c-Cbl缺乏的树突状细胞中，白细胞介素-10的产生减少可能是结肠炎发展的一个启动因素，而不是白细胞介素-12p40。

作者进行了免疫细胞化学染色，以确定结肠炎发病期间CLP细胞中c-Cbl介导的IL-10产生的来源。虽然研究发现CD11c⁺细胞中的c-Cbl缺乏对经DSS处理的c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠CLP细胞中CX3CR1⁺MNP和DC的百分比没有影响（图3E和F），但作者观察到，在结肠炎发病期间，来自c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠的CLP中产生IL-10的DC的频率低于对照同窝c-Cbl^f/f小鼠的频率（图3G）。相反，在患有DSS诱导的结肠炎的c-Cbl^f/f和CD11c^Cre/+c-Cbl^f/f小鼠之间，CLP细胞中产生IL-10的CX3CR1⁺MNP的频率没有差异（图3G）。结果表明，在DSS诱导的结肠炎中，c-Cbl介导的肠道真菌诱导树突状细胞（DC）产生IL-10。

图3 | c-Cbl的DC特异性缺乏损害了α-mannans诱导的IL-10产生

4.DC 特异性c-Cbl 缺乏促进了α-甘露聚糖诱导的RelB激活，以抑制IL-10产生，从而加重DSS诱导的结肠炎

作者观察到c-Cbl缺乏显著增加了α-甘露聚糖诱导的树突状细胞中AKT的磷酸化，表明c-Cbl介导的DC产生IL-10的调控不依赖于Akt信号。作者还发现BMDCs中c-Cbl缺乏并不影响α-甘露聚糖诱导的Syk、ERK、JNK（c-JUN N-末端激酶）或p38或NF-κB抑制剂IκBα的磷酸化（图4A）。此外，骨髓基质细胞中c-Cbl缺乏并不影响α-甘露聚糖诱导的p65移位到细胞核中（图4B）。值得注意的是，骨髓基质细胞中c-Cbl缺乏促进了α-甘露聚糖诱导的RelB核移位，即促进了α-甘露聚糖诱导的RelB的激活。其中，RelB是非经典NF-κB的一个亚单位（图4B）。

研究表明，RelB的激活依赖于NF-αB诱导激酶（NIK）的稳定。NIK抑制剂异喹啉-1，3(2H，4H)-二酮处理显著抑制c-Cbl缺陷BMDCs中α-甘露聚糖诱导的RelB核移位（图4D）。此外，作者发现经α-甘露聚糖、从白念珠菌和热带葡萄球菌酵母中提取的甘露聚糖处理c-Cbl缺陷的BMDCs后，NIK抑制剂处理可以显著增加IL-10的表达和产生（图4E），但对野生型和c-Cbl缺陷BMDCs的IL-10和IL-6的表达和产生并无显著影响（图4E）。RemB基因的敲除也显著增加了α-甘露聚糖诱导的c-Cbl缺陷BMDCs中IL-10的产生，但不能促进野生型BMDCs中IL-10的产生（图4F）。总之，结果表明，DC中c-cbl的缺乏促进了α-甘露聚糖诱导的RelB的激活，从而抑制了IL-10的产生。

c-Cbl缺乏促进了α-甘露聚糖诱导的RelB与核室中p65的结合（图4G）。作者进一步进行了染色质免疫沉淀（CHIP）试验，观察到在α-甘露聚糖刺激的c-Cbl缺乏的BMDCs中，p65和RelB与IL10启动子有实质性的结合（图4H）。为了确定RelB是否调控IL10的转录表达，进行了 IL10和IL6荧光素酶基因报告实验，发现RelB在293T细胞中的过表达并不诱导IL10启动子的激活（图4I），但是p65在293T细胞中的过表达诱导了il10启动子的激活（图4I）。此外，293T细胞中RelB过表达完全阻断了p65介导的IL10启动子的激活，但却没有阻断IL6启动子的激活（图4I）。综上，RelB通过抑制p65介导的BMDCs中IL10的转录来抑制α-甘露聚糖诱导的IL-10的产生。

图4 | c-Cbl的DC特异性缺乏促进了α-mannans诱导的Relb激活，抑制了IL-10的产生，从而加重DSS诱导的结肠炎。

5.C-Cbl介导的α-甘露聚糖诱导的RelB泛素化和降解

研究发现，当RelB和c-Cbl在293T细胞中共同表达时，RelB和c-Cbl是相关的（图5A）。此外，作者发现c-Cbl与RelB的相互作用需要TKB和RF-PR结构域，而不需要UBA结构域（图5B）。此外，在用α-甘露聚糖或白色念珠菌菌丝刺激后，内源性RelB与BMDC中的c-Cbl可诱导共免疫沉淀（图5C和D）。然而，抑制Syk显著阻断了α-甘露聚糖诱导的RelB与BMDC中的c-Cbl相互作用（图5E）。为了检测c-Cbl是否可以泛素化RelB，作者用α-甘露聚糖刺激来自c-Cbl^f/f和c-Cbl^f/fCD11c^Cre/+小鼠的BMDC，发现α-甘露聚糖刺激增强了野生型BMDC中RelB的泛素化（图5F）。然而，c-Cbl缺乏显著削弱了α-甘露聚糖诱导的RelB泛素化（图5F）。同时，c-Cbl在293T细胞中的过表达促进了RelB的泛素化（图5G）。

相反， c-Cbl^C379A（一种对应于人c-Cbll^C381A的连接酶死亡突变体）的过表达显著抑制了RelB泛素化（图5H）。因此，在α-甘露聚糖刺激后，在c-Cbl缺陷的BMDC中信号诱导的RelB降解被显著阻断（图5I）。此外，BMDC中的Dectin-2缺乏也显著阻断了α-甘露聚糖诱导的RelB降解（图5J）。因此，结果表明c-Cbl介导了α-甘露聚糖诱导的RelB泛素化和降解，以通过Dectin-2抑制其激活。

图5 | c-Cbl介导的α-mannans诱发的RelB泛素化和降解

6.c-Abl通过激动剂DPH的激活促进对于c-Cbl介导的RelB激活的抑制，从而抑制了DSS诱导的结肠炎

已有研究表明，c-Cbl的酪氨酸磷酸化由非受体酪氨酸激酶Abelson（c-Abl）调节。研究发现内源性c-Abl在α-甘露聚糖刺激后被BMDC中的抗c-Cbl免疫沉淀（图6A）。此外，研究发现抑制Syk完全阻断了α-甘露聚糖诱导的c-Abl与BMDC中c-Cbl的结合（图6B），表明c-Abl与c-Cbl的相互作用依赖于Syk介导的信号传导。

此外，用c-Abl抑制剂甲磺酸氟马替尼处理或敲除野生型BMDC中的c-Abl显著抑制了α-甘露聚糖诱导的c-Cbl磷酸化（图6C和D）。在野生型BMDC中，甲磺酸氟马替尼处理或c-Abl敲低显著抑制了由α-甘露聚糖诱导的RelB降解（图6E和F）。甲磺酸氟马替尼处理促进了α-甘露聚糖诱导的RelB在野生型 BMDC中的核易位（图6G）。因此，甲磺酸氟马替尼处理或野生型BMDC中的c-Abl敲低显著削弱了α-甘露聚糖诱导的IL-10产生，但不影响IL-6的产生（图6H和I）。这些结果表明，c-Abl的抑制促进了α-甘露聚糖诱导的RelB活化，从而通过抑制c-Cbl酪氨酸磷酸化来抑制IL-10的产生。

相反，用c-Abl激动剂DPH 处理可以协同增加c-Cbl的磷酸化和α-甘露聚糖刺激后野生型BMDC中RelB的降解（图6J和K）。此外，研究发现DPH处理可以使野生型小鼠对DSS诱导的结肠炎具有更强的抵抗力，其特征是体重减轻的程度减小、结肠长度更长、免疫损伤更轻（图6 L-O）。总之，结果表明c-Abl通过其激动剂DPH的激活可以抑制c-Cbl介导的RelB激活，从而限制DSS诱导的结肠炎。

图6 | c-Abl 通过激动剂 DPH 的激活抑制了 c-Cbl 介导的 RelB 激活，从而限制 DSS 诱导的结肠炎

本研究旨在探讨c-Cbl在调节肠道炎症中的作用。作者利用DSS模型小鼠模型阐明了c-Cbl/ RelB轴在调节真菌诱导的肠道炎症中调控的具体分子机制：

1) 肠道真菌来源的甘露聚糖通过 DC 中的 Dectin-2 和 Dectin-3 激活 c-Cbl，从而促进 c-Cbl 介导的非经典 NF-κB 家族成员 RelB 泛素化和降解；

2) DC 中 c-Cbl 的特异性缺乏促进了 α-甘露聚糖诱导的 RelB 激活，从而抑制了经典的NF-κB 亚基 p65介导的 il-10 转录，最终使小鼠更容易受到DSS诱导的结肠炎的影响。

图7 | E3 泛素连接酶 c-Cbl 通过抑制肠道真菌诱导的非经典NF-κB信号通路的激活从而限制结肠炎的拟建模型

本研究发现， c-Cbl 作为Dectin-2 和 Dectin-3 下游的负信号介质，可介导非经典 NF-κB 家族成员 RelB 的泛素化和降解。结果表明，树突状细胞 (DC) 中的 c-Cbl 特异性缺乏会促进 α-甘露聚糖诱导的 RelB 激活，从而抑制  p65介导的抗炎细胞因子基因 IL10 的转录表达，加重 DSS 诱导的结肠炎。用氟康唑抑制真菌生长或抑制体内 RelB 激活可减轻具有 DC 特异性 c-Cbl 缺失的小鼠的结肠炎。此外，通过证明c-Cbl 和 c-Abl 酪氨酸激酶之间的相互作用，发现用 DPH（一种 c-Abl 激动剂）处理可协同促进真菌诱导的 c-Cbl 激活以抑制结肠炎的发生。总而言之，这些发现揭示了以前未知的真菌诱导的 c-Cbl/RelB 轴， c-Cbl/RelB 轴对于调节真菌诱导的肠道炎症以维持肠道稳态至关重要。

本研究通过建立葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型探讨E3泛素连接酶c-Cbl在调节肠道炎症中的作用。采用ChIP检测、荧光素酶报告分析、基因芯片， LC-MS/MS质谱鉴定，免疫沉淀和泛素化测定，再通过WB及qRT-PCR验证， 从而研究C-CBL / RelB轴对于调节真菌诱导的肠道炎症的影响机制。

参考文献：

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Flora 撰文

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