空间代谢组 | IF=13！空间代谢组发现脑肠轴交流的介质

肠道微生物组和大脑之间的双向交流现在被认为是神经系统健康的重要媒介。微生物刺激肠道内宿主神经递质的产生，并合成宿主识别的神经递质。它们还可以刺激宿主免疫系统，导致炎症和肠道微生物群组成的显著变化。虽然微生物衍生的分子（如短链脂肪酸）可以穿过大脑发挥其作用，但大多数影响微生物组-肠-脑（Microbiome-gut-brain，MGB）轴的微生物分子通过高度消耗的肠道和迷走神经间接介导其作用。

C57BL/6 GF和SPF小鼠的脑和肠切片进行MALDI-MSI检测

为了鉴定介导MGB轴通讯的未知微生物代谢物，我们使用质谱成像（MSI）来鉴定存在于特定无病原体（SPF）C57BL/6小鼠肠道和大脑中但在无菌（GF）C57BL/6小鼠中不存在的分子。我们通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI-MSI）和解吸电喷雾电离（DESI-MSI）在SPF小鼠的肠道和大脑中检测到一种质量-电荷比（m/z）为160.133的分子，其水平比GF小鼠相应组织切片中的水平高出20倍以上（图1）。

■ ■■■■

图1.

MALDI-MSI用于获得高横向分辨率图像，用于脑区分析，DESI-MSI用于进一步的高光谱分辨率分析。

DESI-MSI用于筛选肠道细菌以产生感兴趣的代谢物

从C57BL/6小鼠的肠道微生物群中筛选出产生Met1的肠道细菌菌株。从小鼠粪便中分离的细菌菌株在苛求厌氧菌肉汤（FAB）琼脂平板上生长，然后将菌落重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在玻片上斑点以通过MSI筛选Met1。m/z =160.133处的一个峰值在两个密切相关的菌株中检测到，这两个菌株来自拉克诺菌科的梭状芽孢杆菌XIVa簇，通过16S核糖体DNA（rDNA）测序确定为梭状芽孢杆菌和共生梭状芽孢杆菌（图2）。

■ ■■■■

图2.

粗提物的1H-1H COSY显示出3种相关的三甲基铵衍生物

为了明确阐明其结构，我们对含有Met1的细菌馏分进行了核磁共振(NMR)相关光谱(1H-1H COSY)研究。核磁共振确定Met1是两种结构异构体的混合物，只在甲基侧链的位置不同，位于结构的C3[3-甲基-4-(三甲基氨)丁酸酯(3M-4-TMAB)]或C4[4-(三甲基氨)戊酸酯(4- tmap)]上(图3)

■ ■■■■

图3.

MALDI-MSI转换为二值图像，显示离子图像的强度

由于3M-4-TMAB与肉碱在结构上高度相似，4-TMAP与肉碱的直接前体GBB相似，因此我们用MSI方法研究了3M-4-TMAB和4-TMAP与肉碱在SPF小鼠脑片中的共定位。肉碱是脂肪酸氧化（FAO）的关键介质，以酰基肉碱的形式将长链脂肪酸穿梭于细胞膜进入线粒体，在线粒体中被分解。使用MALDI-MSI进行肉碱可视化，并使用DESI-MSI获得准确的m/z（162.112），以便后续识别（图4）。

■ ■■■■

图4.

DESI-MSI对小鼠大脑内3M-4-TMAB和4-TMAP进行定量

根据3M-4-TMAB和4-TMAP代谢产物的结构表征，合成各自的标准物，并通过MSI来量化SPF脑内的内源性浓度。通过NMR测定，3M-4-TMAB和4-TMAP在细菌样品中以等摩尔水平存在(图3);因此，将3M-4-TMAB和4-TMAP的标准品等量混合，在进行MSI分析前，将该标准品的规定浓度点在GF脑上，生成浓度曲线。以此来确定SPF脑内内源性代谢物的浓度。经测定，全脑代谢产物的平均浓度为0.37 ~ 0.4 μM。胼胝体和海马的平均浓度较高，约为13 ~ 17.1 μM，表明3M-4-TMAB/4-TMAP在这些区域有明显的积累(图5)。

■ ■■■■

图５.

OCR被用作抑制FAO的一个指标

考虑到细菌3M-4-TMAB和4-TMAP与宿主肉碱的结构相似性和空间共定位性，我们推测这些细菌分子可能抑制宿主细胞的肉碱功能。使用合成的3M-4-TMAB和4-TMAP，我们在海马分析仪（Seahorse Bioscience）上使用XF棕榈酸酯-牛血清白蛋白（BSA）FAO底物，在中枢神经系统（CNS）白质的原代小鼠细胞培养模型中测试了它们在肉碱存在下抑制线粒体功能的能力。这种方法以氧消耗率（OCR）作为读数来测量FAO，因此可以评估一种分子是否能够抑制FAO。小鼠脊髓源性细胞在体外培养8天，然后在0.5 mM肉碱、3M-4-TMAB和4-TMAP单独或联合存在下，在2 mM下培养24小时。单独使用3M-4-TMAB（在四个生物复制中减少12%）、4-TMAP（减少14%）或3M-4-TMAB/4-TMAP等摩尔混合物（减少17%）显著抑制FAO（图6）。

■ ■■■■

图6.