Microbiome | 11分！喝了开菲尔酸奶的小鼠更开心？！

越来越多的证据表明，肠道微生物群通过脑肠轴的双向通信，在调节大脑生理和行为方面发挥作用。各种营养干预措施已被证明会影响脑肠轴，益生元和益生菌因此受到了特别的关注。通过操纵微生物群来调节情绪的干预被称为心理生物学。发酵食品也可能对情绪方面产生有益影响，摄入发酵食品可减少人类的社交焦虑和妊娠抑郁。开菲尔是一种传统的发酵牛奶，源于高加索山脉，开菲尔的许多健康益处已被证实，如动物模型中的抗炎作用，降低高脂饮食诱导的小鼠肥胖症状，以及降低自发性高血压大鼠的高血压。最近的一项随机对照试验表明，开菲尔可以减轻炎症性肠病患者的腹胀并改善他们的情绪。开菲尔酸奶也已被证明可以调节小鼠肠道微生物群的组成。

目前还不清楚开菲尔是否对微生物-肠道-大脑轴有不同的影响，以及它们本身是否能调节宿主的行为。为了解决这个问题，研究者用两种不同的开菲尔(Fr1和UK4)和未发酵的牛奶口服管饲法给药小鼠，并对小鼠进行了一系列测试，以确定它们的行为表现型。此外，对小鼠回肠、盲肠和粪便物质进行宏基因组测序，并进行粪便代谢组学分析。最后，评估小鼠全身免疫反应和肠道血清素水平。

开菲尔调节重复行为和寻求奖励的行为

在大理石掩埋试验中，我们发现UK4给药减少了大理石的掩埋数量，表明重复性行为减少(图1a)。在测试评估中没有观察到焦虑样行为的变化，如高架桥迷宫、开放场地测试和应激诱导的热疗法测试以及强迫游泳测试和尾巴悬吊测试中的抑郁样行为。在雌性尿液嗅探试验中，与未受干扰的小鼠相比，牛奶给药的小鼠与含水棉球互动的时间更短， Fr1和UK4给药均改善了这一点(图1b)。此外，接受UK4的小鼠与含有雌鼠尿液的棉球互动的时间更长 (图1b)。

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图1.

开菲尔–UK4调节情境学习和记忆

在第1阶段——获得阶段的恐惧条件反射测试中没有观察到差异，这是由小鼠在提示呈现期间以及提示之间的冷冻时间决定的(图2a，b)。此外，在第2阶段评估线索依赖性恐惧记忆时，没有发现差异(图2c)。然而，接受UK4的小鼠在第3阶段——情境记忆中表现出冷冻行为增加的趋势(图2d)。

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图2.

开菲尔对外周免疫系统的影响不同

与未受干扰的小鼠相比，接受牛奶的小鼠中循环的LY6C^high单核细胞增加，表明先天免疫系统的激活。此外，外周循环中各种炎症细胞因子的水平增加。与这一发现一致的是，牛奶给药诱导小鼠中性粒细胞水平增加(图3a)，开菲尔-Fr1给药改善了这一现象 (图3a)。类似地，Fr1改善了通过牛奶灌胃慢性应激小鼠中观察到的CXCL1水平的增加 (图3b)。UK4增加了肠系膜淋巴结(MLNs)中调节性T细胞(Treg) (图3c)，这是一种已知由肠道微生物代谢物诱导的抗炎辅助性T细胞亚群。这些细胞不表达Helios转录因子 (图3d)。

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图3.

开菲尔–Fr1选择性增加结肠血清素活性

与未受干扰的小鼠相比，接受牛奶的小鼠回肠5-羟色胺水平降低 (图4b)。这导致5HIAA/5-HT比率增加 (图4c)，表明血清素周转和血清素活性增加。在结肠中观察到相反的情况，其中牛奶导致5-羟色胺水平增加 (图4e)，同时降低5HIAA/5-羟色胺比率 (图4f)。Fr1改善了结肠而非回肠的这种现象 (图4e，f)。

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图4.

两种开菲尔给药影响小鼠肠道菌群

开菲尔UK4增加盲肠中的菌群α多样性，但不增加回肠和粪便中的菌群α多样性 (图5a)。施用Fr1和UK4的菌群α多样性中没有发现显著差异。两种开菲尔处理均影响小鼠肠道菌群β多样性。总共有15种细菌被鉴定为差异菌群 (图5c)。两种开菲尔增加了Lachnospiraceae bacterium 、Propionibacterium　acnes 、Bacillus amyloliquefaciens 在肠道中一个或多个区域的丰度。只有Fr1增加了Parabacteroides goldsteinii, Bacteroides intestinalis, Anaerotruncus unclassified ，Parabacteroides goldsteinii 丰度。只有UK4增加了Alistipes unclassified丰度，降低了Candidatus Arthromitus unclassified 丰度。研究者随后将显著改变的行为和免疫参数与微生物群细菌种类关联(图6)。最值得注意的是C. Arthromitus unclassified 丰度与循环 Treg细胞水平之间的相关性，以及B. pseudolongum丰度和循环中性粒细胞水平之间的相关性。

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图５.

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图６.

开菲尔引起肠道微生物群功能变化

Fr1在回肠和盲肠的微生物组中诱导了显著的功能变化，但在粪便中没有 (图7a)。类似地，UK4在盲肠和粪便中诱导了显著的功能变化，但在回肠中没有 (图7a)。使用气相色谱-质谱检测每组(n = 6)动物的粪便代谢物，以验证在肠道微生物群落的预测功能潜力中观察到的任何变化。对粪便代谢组β多样性的分析显示，开菲尔Fr1对测得的代谢物有显著影响。值得注意的是，在包括短链脂肪酸(SCFA)水平在内的p值调整后，任何一对组之间的任何化合物浓度都没有显著差异。在肠道至少一个区域的至少一对组之间，共有59个level-4 enzyme commission  (EC)类别存在差异。值得注意的是，在涉及神经活性物质产生的几个EC类别中存在显著差异(图7b)。具体地说，产生谷氨酸盐的回肠谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(异构化)(EC 2.6.1.16)水平通过Fr1和UK4给药而升高。

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图７.

开菲尔增加了Lactobacillus reuteri菌株产生γ-氨基丁酸（GABA）的可能性

与牛奶对照组相比，接受Fr1的小鼠盲肠“对甲酚生物合成”减少，而粪便中“喹啉酸合成”减少。在接受UK4的小鼠中，回肠“肌醇合成”和“γ-氨基丁酸降解”增加。在接受开菲尔Fr1 、UK4 小鼠γ-氨基丁酸合成的增加归因于Lactobacillus reuter。在接受Fr1 和UK4的小鼠粪便中，P. goldsteinii的GBM“S-腺苷甲硫氨酸合成”更高。γ-氨基丁酸反转运体，可能参与细胞谷氨酸的输出。类似地，检测到的Lactobacillus reuteri菌株还被发现编码与谷氨酰胺产生谷氨酸相关的两种酶:谷氨酰胺酶和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(异构化)。重要的是，这种菌株编码谷氨酸脱羧酶，通过谷氨酸脱羧产生γ-氨基丁酸，以及谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白。根据Lactobacillus reuteri产生γ-氨基丁酸的预测能力，我们观察到Lactobacillus reuteri和粪便中2-氧代戊二酸水平之间呈负相关。

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图8.