客户文章 | AICAr通过诱导急性淋巴细胞白血病细胞中的NTP和d NTP库失衡来抑制细胞增殖

 ● 期刊：Faseb Journal

 ● IF=5.498

 ● 发表时间：2019-01-31

儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童白血病中最常见的一种形式。尽管目前人们在ALL治疗方面取得了重大进展，但复发仍然是ALL患者死亡的主要原因。研究表明，嘌呤核苷5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷（AICAr，也称为acadesine）作为一种抗肿瘤剂，可以诱导神经母细胞瘤，胰腺癌，肝癌，骨肉瘤，ALL和慢性淋巴细胞白血病（CLL）等多种肿瘤细胞的凋亡。据报道，AICAr作用机制主要包括通过AMPK独立机制抑制胶质瘤的增殖，也有文献提出AICAr通过AMPK非依赖性机制诱导CLL和Jurkat细胞凋亡等。由此可见，虽然AICAr可以抑制ALL患者细胞中的细胞增殖并诱导细胞凋亡，但其作用机制尚不清楚，存在很大争议。由于磷酸化产物AICAR是嘌呤生物合成的penul-timate中间体，AICAr可能对核苷酸代谢产生选择性作用。

今天小迈介绍的这篇文章就针对以上问题，先做了AICAr可能通过调节核苷酸代谢来抑制ALL细胞增殖的假设，并运用代谢组学技术确认了AICAr对儿童ALL细胞中的核糖核苷三磷酸（NTP）和脱氧核糖核苷三磷酸（d NTP）池平衡具有选择性作用。相关结果发表在权威杂志FASEB journal杂志上，影响因子5.498。

NALM-6细胞和Reh细胞

该研究先通过CRISPR / Cas9敲除了NALM-6和Reh细胞中的TP53或PRKAA1基因（编码AMPKa1），确认AICAr抑制肿瘤细胞的增殖是依赖于p53而不是AMPK活化。再采用LC-MS /MS仪器，以多反应监测模式分析核苷酸代谢物NTP和dNTP的含量以及嘌呤生物合成途径中相关的核酸代谢物，确认AICAr是否通过上调嘌呤生物合成引起嘌呤和嘧啶之间的NTP和d NTP库失衡。

AICAr诱导ALL细胞中的细胞周期停滞和凋亡

生长曲线显示0.5mM AICAr抑制NALM-6细胞的增殖（图1A），1mM AICAr抑制Reh细胞的增殖（图1B）。凋亡分析表明AICAr在对NALM-6和Reh细胞处理后48小时诱导其凋亡（图1C，D）。

细胞周期结果表明AICAr诱导NALM-6细胞中24小时的早期S期停滞（图1E），但在Reh细胞中没有（图1F）。这些结果表明AICAr通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡来抑制ALL细胞增殖。

 AICAr抑制ALL细胞增殖作用不依赖于AMPK活化

NALM-6和Reh细胞均仅表达催化亚基AMPKa1而不表达旁系同源物AMPKa2（图2A）。CRISPR / Cas9敲除了NALM-6和Reh细胞中的AMPKa1编码基因PRKAA1后的蛋白表达（图2B）。在两种ALL细胞系中，AMPKa1敲除均未影响药物对AICAr的敏感性（图2C，D）。

Western blot结果表明，在NALM-6细胞中，2mM AICAr导致γH2AX显着增加，并且0.5mM AICAr最大激活AMPK（图2E）。在Reh细胞中，5mM AICAr导致γH2AX显着增加，并且1mM AICAr强烈激活AMPK（图2F）。这些数据表明双链断裂（DSB）和AMPK活化是分开进行的，并且AICAr诱导的ALL细胞增殖抑制不依赖于AMPK活化。  

AICAr诱导的增殖抑制依赖于ALL细胞中的p53

将TP53敲除后，Western印迹结果显示NALM-6和Reh细胞中S15和S20处的p53蛋白积累和磷酸化以及野生型p53（C-末端Flag-和P2A-标记的）再表达细胞（图3A）。

在通过CRISPR / Cas9敲除两种细胞系中的内源型TP53后，AICAr诱导的细胞凋亡减少（图3B，C）。当外源Flag和P2A标记的野生型p53在TP53敲除细胞中重新表达时，AICAr诱导的细胞凋亡得以恢复（图3B，C），并且AICAr的IC50降至与原来的NALM-6和Reh细胞相同水平（图3D，E）。这些结果表明，apo-ptosis和药物敏感性的变化与TP53敲除特异性相关，即AICAr以p53依赖性方式抑制ALL细胞增殖。

 AICAr诱导NTP和d NTP库失衡，导致所有细胞中的r RNA转录扰乱和DNA复制应激

AICAr被腺苷激酶磷酸化成AICAR并参生物合成途径（图4A）。AICAr上调了琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-核糖-59磷酸（图4B），AICAR（图4C），肌苷一磷酸（图4D），肌苷（图4E）和次黄嘌呤（图4F）的细胞浓度。AICAR的下游代谢物（例如肌苷一磷酸，肌苷和次黄嘌呤）在细胞中的积累表明AICAr被有效代谢。

图5. AICAr诱导NTP和d NTP库失衡，导致NALM-6细胞中RNA转录效率和DNA复制叉速度降低。LC-MS结果显示，AICAr上调ATP水平，GTP水平不变（图5A，B），下调UTP和CTP水平（图5C，D）。

47S pre-r RNA，与r RNA转录率呈正相关，可作为r RNA转录率的指标。AICAr显著降低了47S pre-r RNA的表达（图5E）。此外，AICAr增加了NALM-6细胞中脱氧腺苷三磷酸（d ATP）和脱氧鸟苷三磷酸的水平（图5F，G），降低了脱氧胸苷三磷酸和脱氧胞苷三磷酸的细胞浓度（图5H，I）。正如DNA测定结果所示，AICAr减慢了NALM-6细胞中的DNA复制叉速度，提示复制应激（图5J）。该结果与AICAr诱导NALM-6细胞的非复制性S期阻滞一致。

外源性尿苷通过重新平衡ALL细胞中的核苷酸库来减弱AICAr诱导的增殖抑制和凋亡

图6.  仅用AICAr（红色）或在不同浓度的尿苷（蓝色）存在下孵育的NALM-6细胞的（图6A）。Western印迹显示用对照DMSO，1mM AICAr，1mM尿苷或两种药剂的组合处理的NALM-6细胞中，尿苷减少了由AICAr诱导的γ H2AX和p53积累（图6B）；在细胞凋亡测定中，尿苷阻止AICAr诱导的细胞凋亡（图6C），与尿苷处理后裂解的PARP的减少一致；尿苷显著减少由AICAr诱导的非复制性S期细胞群（图6D）；代谢LC-MS结果显示尿苷重新平衡了嘌呤核糖核苷酸库与嘧啶核糖核苷酸库的比例（图6E）。 尿苷恢复了47S pre-r RNA的表达（图6F），尿嘧啶也重新平衡嘌呤脱氧核糖核苷酸库与嘧啶脱氧核糖核苷酸库的比例（图6G）。尿素挽救了DNA复制叉停滞（图6H），表明尿苷减弱了AICAr引起的复制应激。

AICAr在嘌呤合成途径中引起核糖-5-磷酸（R5P）增加和磷酸核糖焦磷酸酯（PRPP）水平降低（图7A，B）。作为嘧啶生物合成的底物，PRPP短缺可能限制UMP合成酶催化的尿苷一磷酸（UMP）合成，导致乳清酸（Orotate）积累和UMP降低（图7C，D）。

基于以上数据，该研究总结了一个解释AICAr如何抑制ALL细胞中细胞增殖的工作模型（图7E）。

本研究证明了AICAr通过诱导NALM-6细胞中的NTP和d NTP库失衡抑制增殖，S期细胞周期停滞和细胞凋亡，而不是文献报道过的通过激活AMPK途径。此外，由于实验选取了NALM-6和Reh两种细胞，还表明了AICAr的机制可能在敏感和抗性细胞系之间不同，且这种敏感性差异的细节机制仍然难以捉摸。该实验不仅阐述了AICAr诱导ALL细胞的细胞毒作用的详细机制，而且阐明了AICAr在未来ALL治疗中的潜在临床应用。

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