直播回放 | 蒋宏峰教授课程回顾

2021-05-19 17:52:27, 小迈武汉迈维代谢生物科技股份有限公司

首都医科大学附属安贞医院蒋宏峰教授在4月15日为我们解析了代谢组学的基础研究与临床应用知识，今天小编给大家带来了直播回放与视频文字版内容，意犹未尽的小伙伴快来一起看看吧。

蒋宏峰教授直播完整录屏回放

今天的主讲领域是医学代谢组学，包括代谢组学的基础研究和临床应用。人体代谢是非常复杂化的网络时空调节，其中有不同时段、状态、生理、病理状态下及不同空间定位，包括数千种已知的或未知的代谢物。代谢组研究的基本流程，首先是样本，包括汗液、尿液、血浆、血清、组织、粪便等；检测目前最常用的手段是质谱，其实最早用的是核磁共振，但由于质谱和液相色谱卓越的重现性、对复杂样本的处理能力、对物质的分离能力，现在主要用的是LC-MS、GC-MS等，核磁共振主要用于物质鉴定而不是测量。当得到一定信息后，进行信息学的数据分析，查找到与某些生理过程或疾病相关的物质，进行体外或在体的动物模型研究，实现临床应用，如检验方面、疾病诊断、治疗监控、用药指导、预后判断等，再回到离体或动物实验进行机制研究，最后形成这样一个闭环。

人体是很复杂的过程，在研究代谢物时一般分为两种方法，一种是靶向分析，它的特点是主要针对已知化合物，如脂肪酸、胆汁酸，优点是定量性比较好，缺点是检测物质有限；另一种是撒渔网的方式，一次可以检测几百种上千种物质，但随着检测物质增多，检测的准确性不足。近年来，在国内专家的倡导下，我们也开展了标准物质库及拟靶向的工作，介于非靶和靶向之间、半定量的广谱代谢组学。

当我们提到质谱，先说一下质谱发展史。质谱至今仅有一百多年历史，最初是用于无机化学的同位素分析，随后出现串联质谱、有机质谱并用于代谢物测定，商品化是到了70年代末，然后出现了液相质谱的串联接口，使得物种筛分和质量检测能够很好的完成界面交汇一体化。接着出现蛋白质质谱进展为质谱蛋白组，随后又形成质谱代谢组。2004年之后，从液相发展为超高效液相，随后至今，由于精准医学的提出，精准检验开始实行，质谱在代谢组应用于临床检测。

对于质谱检测，有两种基本模式，一种是单质谱，在复杂混合物中，一群分子冲过质量筛分器后，它只允许特定质量的物质通过。如游离脂肪酸是一种难以被检测的物质，需要衍生化，当它进入质谱后，直接测它单个分子质量，再结合色谱，得到相应质谱峰。代谢组和代谢物的测定既有区别又有联系。代谢物一般一次只能测定某一个物质，代谢组则可以用试剂盒、发光法、显色法、酶法等测总的游离脂肪酸，没有办法看到其中各个组分含量；当使用质谱时，可以精确检测各个脂肪酸的种类到底有多少。

另一种质谱模式叫串联质谱。串联质谱第一部分和单质谱类似，只允许混合物中特定质量的物质通过，中间是碰撞室，用惰性气体把分子打碎。大家知道分子间结合的键能是不同的，需要大于键能的能量才能把分子打碎，形成的碎片是有特征性的，第三部分只允许特定碎片通过。混合物中很多分子量非常接近，很难用单模式分离，但打碎后产生的二级质谱有很大差异，通过测定选择，就能找到特殊的化合物，另外根据这种模式可以筛分掉大量干扰物质，降低噪音，提高灵敏度和信噪比。一般情况下，满足三个条件，才能认定一个化合物：1）一级质谱必须是它的母离子；2）二级质谱必须有特征碎片；3）在色谱中的洗脱时间必须在合理范围之内。

代谢组的应用。代谢组是对生物体内外源性小分子物质进行系统定量研究，并寻找疾病的临床干预靶点的一种手段。目的是运用分子检测技术，为临床诊断治疗提供理论依据和数据支持。最终将基础临床研究结合，实现科研成果向临床转化。

下面讲一讲医学代谢组学的基础研究。人体的疾病有很多表型，是由很多内外源因素共同造成的，首先本源上是基因遗传学，其次是年龄、环境、药物、营养、生活习惯。

从信息流动和多组学的关系来看，人体认识过程是这样的：首先最基本的是DNA，DNA转录成RNA，RNA翻译成蛋白用来执行细胞功能，蛋白中的大部分功能是酶催化作用，它的产物是代谢产物。代谢产物能够最直观的指示生物体当前处于什么状态，与我们的生活和生理疾病有什么关系。

代谢组学的应用包括科研平台、论文发表、试剂盒开发、国际数据库等。

如何进行代谢组学研究？第一步，查阅文献；第二步，确认待检测物质的理化性质；第三步，配制初级、二级标准品母液；第四步，采集一级、二级质谱参数；第五步，利用标准品确定色谱柱与流动相；第六步，确定检测上下限；第七步，确定内标和外标之间无交叉污染；第八步，根据需要建立标准曲线；第九步，确认基质效应；第十步，确定回收率和预处理回收率（正确度、精密度），确认组内差异（<10%）和组间差异(<15%)。

这里强调，代谢组学是工具不是目的；生物信息学是工具不是目的；我们的目的是解决代谢想象与机制的理论问题并指导实践；将代谢组学数据与医学生物学机制结合分析是关键点。

下面举个例子，如何将功能学和代谢组学结合起来。脂质在体内主要做细胞膜的主要成分，还有做储能成分，心脏主要有脂肪酸供能。在心衰的情况下，心脏供能由脂肪酸变为葡萄糖供能。此外体内还由很多含量很低的生物活性脂质如Ceramide。神经酰胺在不同疾病不同组织中有不同的转变途径。脂肪酸过载能够诱导我们心肌病变。

下面这张图展示了我们早年研究情况。可以看到我们从脂代谢中截取一小块出来的。脂肪酸可以转变为神经酰胺、磷脂酰胆碱等。这里面每一个节点都有相应的文章，每一个节点都有不同的疾病模型可以去做。那么推而广之就是有无数的代谢节点可以去探索。

下面讲代谢组医学的研究。科研是从动物做起的，从体外到体内。队列加上组学就是一把利器。能够让我们反过来做，先不做动物而从临床入手，从患者入手，进而探究其具体机制。这样的文章有很多。什么是队列？队列是特定人群范围内的研究对象，这些队列一部分是暴露在特定危险因素下的，另一部分是非暴露组的。那么就会出现某种结局（疾病），比如冠心病。为什么说队列研究很重要呢？这张图展示了循证医学从低质量的数据到高质量的数据比较。可以看到体外研究是最没有说服力的，越往上越有说服力。

神经酰胺是一类复合脂质，是鞘脂代谢的核心分子。其血中浓度与动脉粥样硬化斑块形成、缺血性心脏病和心肌梗死、高血压、中风及2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖均相关。

下面是我们心衰的研究结果。

动物实验结果如下：

所以对于临床研究来说，我们不再是从细胞动物开始，而是从临床疾病队列开始如下图。

我们目前并没有医学代谢组学的数据，但是我们可以看其他的两个数据。全球体外诊断市场千亿美元规模，代谢组市场接近20亿美元。体外诊断产业主要为国外企业。我国年增长率远超世界平均增速，我国人均年花费3.5美元，远低于欧美人均30美元水平。其次国内体内外代谢物质谱检测非常少，各自为战。另外我们IVD体外使用药物监测或者环境种的毒素都有。我们上升空间非常大。

血浆神经酰胺测定是可以打破心血管疾病的高发病率、致残率、致死率和高额医疗费的。国外一个神经酰胺研究项目如下：

神经酰胺除了在心血管疾病中起作用外，还在其他的疾病中也起作用，例如糖尿病。除了神经酰胺外，还要很多的代谢物都和多种疾病有关，数千种几百大类的化合物在临床中都有应用前景，问题就是谁去做，怎么做，怎么抓到这些有效结果，就寄希望于各位同学各位同道，在今后的工作中大家一起努力。

Q：测短链脂肪酸的话，用大鼠的血还是粪便更好？

A：都有价值，SCFAs很多功能。看目的是什么，如果是测血，血中的短链脂肪酸是细胞代谢消耗之后所得到的，是体内代谢，少部分来自肠道。肠道中短链脂肪酸一部分是来自自身代谢产物，很大一部分是来自肠道菌群，而不是机体内源性的。如果你要研究的是短链脂肪酸对人体或某种疾病，一般来说血液是好的选择，它是机体一个整体反映的综合，血液样本比较好做，如果你要看肠道菌群的变化，用粪便会比较合适，当然粪便也可以做。

Q：鞘胺醇是神经酰胺的前体，神经酰胺在疾病中降低的话，鞘胺醇是升高还是降低？

A：这个不一定。神经酰胺的合成，鞘胺醇是前体，但是不仅仅是鞘胺醇。看一下通路的话，鞘脂在酶作用下也可以反过来合成神经酰胺。神经酰胺至少有四个来源。所以他们之间没有绝对关联，还是要看具体的生理病理变化。

Q：做标准曲线时，标品是用纯溶剂还是用基质去配置呢？比如说测血浆样本，怎么获得不含代谢物的血浆样本。

A：很多时候没法获得不含待测物的血浆，一般使用白蛋白溶液，也就是人造血浆。用这个代替血浆，血浆中基质效应很多来自蛋白和磷脂，作用机制我们并不清楚。实践中发现人造血浆可以补偿大多数代谢物的基质效应。有些特殊的，如维生素D，市面上有不含维生素D的血浆卖，再比如脂肪酸，得使用没有脂肪酸的白蛋白溶液。对于我们很多只用人造血浆的时候，有时候确实会几分之一到几倍基质效应的变化，那最好是使用同位素内标，这种情况下基质效应会被抵消。还可以使用标准血清参照物，在我们国家还没有，欧美有了，像1950。

Q：做临床样本的时候，生物学重复设置多少比较合适？

A：需要具体计算。一般来说，不考虑参数的话，我们需要保证每个队列子项目70个以上。如果考虑的是干预模式的效果性，那就更复杂了，具体有个公式。

Q：研究脂质的时候，是不同的碳链长度的脂质都研究还是研究总的？

A：通过代谢组学研究，我们希望看到不同碳链的变化。以前可以用试剂盒检测总的神经酰胺的变化，而现在我们需要确切知道特定碳链长度的神经酰胺的含量，同时还有很多不同长度的神经酰胺被发现。随着技术的发展，后续可能会要扩展模型深入研究。

Q：您讲到神经酰胺对心血管疾病的预警性，那是这一类还是某一种？

A：某几种，我目前用的是积分模型，六个元素构成，包括C16、C18、C20:1三个和这三脂质的绝对定量值分别比上C24的比值，得到六个点，然后每个点给它一个积分。我们既往做研究，都是使用绝对含量。随着代谢的发展，这种积分式的、复合性的模型会越来越占据主导地位。单纯的单一指标模型，仅仅只适用于单基因突变或罕见病，比如新生儿检测，肉碱、有机酸检测这都是遗传病，通过单一或少数几个物质来发现，而我们常见的临床重、大、慢病都是通过多基因和内外综合因素造成的，所以复合模型会是将来明确发展模式，参数会不断优化。

Q：神经酰胺是液质做吗？

A：脂质组学还是以液质为主，少数一些特殊的脂质会用气质，比如脂肪酸、短链脂肪酸。气质优点就是快，缺点就是方法复杂，稳定性差、还需要衍生化。我们现在尽量将气质往液质上转，脂肪酸用液质做已经没有问题了。短链小分子，分子越短检测起来越难，但是我们也可以做衍生化。以前比较难检测的，不易离子化的，像生物胺，我们也考虑衍生化，也是用液质来测。我个人倾向今后能把液质的标准建立得尽量完善，这样的话，测脂质的话就不用气质了。我们看到非靶以液质为主，其中一些短链脂质也可以看得到，只是定量差一些，但是我觉得今后这都不是问题。

Q：目前代谢组研究的大部分都是内科疾病，对于外科方面的研究你怎么看？

A：代谢组主要研究的是内外源性小分子化合物，外源性就是主要是药物和毒品，还有环境污染物。内源性代表的是我们体内本身的代谢变化，那么外科能不能做，也能做。内科一般就是诊断、预警、治疗等。外科的话也可以做一些相关工作，比如动脉夹层是典型的外科疾病，我们有文献报道，关于支链脂肪酸的，维生素D的。哪些患者在得了动脉瘤，手术完后有复发风险，这也是一种代谢分型。对于外科，焦点不是诊断，而是在术后预后检测，风险评估上。比如说，哪些患者术后会出现疤痕，哪些患者在心脏搭桥后会出现桥静脉会闭塞，这些就是涉及到人体内源性的工作了。代谢没办法指导手术术式，但是我们完全有理由相信，人的不同代谢特征会对术后恢复和复发有指导意义，相信这就是代谢的用武之地。

Q：到底是代谢物的变化引起了疾病，还是疾病引起来代谢物的变化？

A：这是一个相关性和因果性的问题。我们在做差异性的时候，是无法得出因果关系的，比如疾病发展某一阶段，某物质上升或者下降，这个代谢物可能跟疾病相关也可能不相关。到底是谁影响谁，我们不知道，需要做干预。刚讲到的神经酰胺跟冠心病，神经酰胺高了，冠心病风险也高了，但是它们之间什么关系，得做干预。心衰很典型，用外科手术控制心衰后，神经酰胺下降了。用药物控制神经酰胺后，心衰也改善了，说明什么？说明它们互为因果。只要出现了代谢的失衡，神经酰胺升高会破坏心肌导致冠心病，而冠心病又会促进神经酰胺上调，导致更严重的心肌损害。阻断这个循环，不管是阻断心衰还是神经酰胺，我们都可以看到同步的变化。在其他绝大多数代谢物和疾病因果性上都可以使用类似模型，只有通过干预，我们才能确定疾病跟代谢物是因果关系还是关联关系。通过文献也可以得到间接证据，比如我们A可以导致B，B可以导致C，我们推断A可以导致C。当然，我们医学不是一门严格意义上的理论科学，很大程度上是实践科学。A能不能到C，需要干预实验来确认。

Q：现在技术这么多，非靶，靶向，多组学等等，该怎么来选？

A：有的放矢，所有的技术都有用武之地，但是需要看你用在什么地方。对于新的领域，没有多少人做的疾病，我们首先考虑的是做大样本量，比如一千例，通过非靶、广靶做筛查，看他整体代谢的变化。对于知道病理生理机制的，知道背后潜藏的代谢变化，就要用靶向去验证。非靶是范围广，量大，但是定量不准，得到非靶结果也是需要靶向验证的，比如鉴定出A是差异，但其实可能给出来是假阳性结果。多组学并不是打断的，是相互交融的，都是要根据我们的需要，需要什么功能来决定。有些功能主要是蛋白来执行的，就需要蛋白组为主，蛋白组也是有很多好的结果，蛋白组热度可能不如十年前热，因为我们这几年获得了大量的数据，在数据处理上遇到了障碍，跟疾病关联不强，只有少数工作做的很好。少数疾病可以用基因组，典型就是单基因疾病、罕见病。对于重大慢病就麻烦一些，比如高血压，目前有2000多种候选基因，确认300多种，用基因组就做不过来，这个时候就可以考虑蛋白组或代谢组。代谢组还可以跟其他组学结合，大部分功能代谢产物是由蛋白催化产生的，代谢物也可以和肠道菌群结合起来，菌群代谢组影响人的代谢组，人代谢影响菌群，都可以进行结合。很难给出用什么组学合适，具体还是看研究的方向和内容。要关注背后的生理病理机制，看它最有可能落在代谢组或蛋白组还是多组学身上。我最喜欢看到能够看到一两个组学结合起来，同时关联到临床上，那样的话价值就很大。