Cell Discovery | 华大智造DNBSEQ-T7助力新冠患者呼吸道微生物组特征研究

2021-04-16 21:35:10, 华大智造市场部深圳华大智造科技有限公司

4月13日，来自深圳华大生命科学研究院、广州医科大学附属第一医院/广州呼吸健康研究院/呼吸疾病国家重点实验室、广州医科大学广州第八人民医院传染病研究所等机构科学家联合在专业期刊《Cell Discovery》在线发表题为“Characterization of respiratory microbial dysbiosis in hospitalized COVID-19 patients”的研究论文。

该项研究利用来自华大智造的DNBSEQ-T7平台对新冠肺炎患者呼吸道和肠道临床标本中提取的总RNA进行预处理、DNA纳米球文库构建和高深度宏转录组测序，并结合实验室快速诊断技术详细解析了不同疾病严重程度新冠患者的微生物组差异特征。研究发现，相比轻症患者，重症患者的呼吸道病毒共感染比例更高，微生物组结构失调更明显，其中多重耐药菌的富集表达对在院重症患者的预后和生存或存在不良影响。

实验方法

实验收集了2020年1月27日至2月26日中国广东省在院新冠患者的共67例临床标本(痰、鼻拭子、咽拭子、肛门拭子和粪便)，来自8例轻度患者和15例重症患者(需ICU和机械通气治疗)；提取样本总RNA进行深度转录组测序，并结合实验室诊断分析，对患者的呼吸道和肠道临床样本中包括病毒、细菌等微生物群落特征进行鉴定与定量分析。

实验步骤

1. 纳入SARS-CoV-2感染的住院患者，收集临床标本。

2. 医院内细菌和真菌感染实验室诊断。

3. RNA提取，宏转录组文库的制备和测序。

对于每个样本，提取总RNA，并定量浓度。纯化的RNA样品在DNBSEQ-T7平台上进行预处理、DNA纳米球文库构建和高通量转录组测序。

4. 从宏转录组数据中识别并去除人类RNA序列。

5. 从宏转录组数据中识别并去除微生物核糖体RNA序列

6. SARS-CoV-2感染住院患者病毒群落特征分析。

7. SARS-CoV-2感染住院患者微生物群落(非病毒)特征分析。

8. 洋葱伯克霍尔德菌毒力因子的鉴定与定量分析。

9. 统计分析。

研究结果

轻、重症患者临床样本的病毒组特征

在呼吸道和肠道共5种临床标本中，研究者均能检测到高表达的SARS-CoV-2病毒，是新冠患者临床样本中表达最丰富的病毒（图1a）。除冠状病毒外，宏转录组分析还揭示出临床样品存在其他大量病毒，其自然宿主包括但不限于动物、细菌和植物（图1b）。其中，在4例（4/13，30.8%）重症患者呼吸道样本中分别检测出高表达的人单纯疱疹病毒1型 (human alphaherpesvirus 1，患者P01和P05)，鼻病毒B型(rhinovirus B，患者P09) 和人呼吸道合胞病毒 (human orthopneumovirus, 患者P13) (图1c)。而轻症患者中则未检测出人相关呼吸道病毒共感染信号。

图1. COVID-19在院患者临床标本的病毒RNA谱

(a). 条形图：从呼吸道和肠道收集的67份临床标本中的总病毒读数和冠状病毒科读数。

(b). 热图：科水平的病毒RNA丰度。展示丰度前16位的病毒科并根据其自然宿主进行排序。

(c). 分布图：4名重症患者感染呼吸道病毒基因组的测序覆盖度和深度的分布。

轻、重症患者临床样本的（非病毒）微生物组特征

研究组进一步揭示了轻、重症患者呼吸道标本显著的微生物RNA表达差异（图2）。尽管轻症患者标本采集自广东省内三所不同地区的医院（广州，阳江和清远），轻症患者的呼吸道样本（6例咽拭子和1例痰液）相比重症样本具有更相似的微生物结构，包括：更高的微生物种类丰富度 (图2a)（轻症平均单样品可检测到28个属和48个种，重症平均单样品仅检测到6个属和4个种）；和更高表达丰度的韦荣氏球菌(Veillonella)、奈瑟菌属 (Neisseria)、链球菌属 (Streptococcus) 和普雷沃菌属 (Prevotella)（图2b，c），这些也是人上呼吸道中的常见共生微生物。相反的，重症患者呼吸道则以伯克霍尔德菌属 (Burkholderia)、葡萄球菌 (Staphylococcus) 和支原体 (Mycoplasma) 为主（图2b，c），而这三个属在轻症患者样本中的丰度极低或未被检测到 (图2a, c)。与宏转录组结果一致，P04和P20 两例重症患者痰培养结果呈洋葱伯克霍尔德菌复合菌阳性（Burkholderia cepacia complex，BCC）；P06号鼻拭子培养结果呈表皮葡萄球菌（S. epidermidis）阳性。