【BEAVER Chat】为什么有些时候蛋白质纯化过程洗脱效率低？（附原因解析及解决方案）

2021-03-23 09:58:44, 小海狸苏州海狸生物医学工程有限公司

很多童鞋们在做蛋白质纯化中常常遇到最终洗脱下来的蛋白很少的现象，其中很大一部分原因是蛋白质在最后的洗脱步骤没有洗脱下来。利用磁珠进行蛋白质纯化的一般原理包括，离子交换作用、亲和作用和金属配位结合。根据结合的原理不同，其洗脱的方式也不尽相同。今天Dr. BEAVER就跟大家聊聊蛋白纯化中遇到的目的蛋白难洗脱的那些事。

专业专注精益求精

图1：蛋白亲和纯化洗脱原理示意图

若发现流穿液中目标蛋白明显减少，但洗脱液中的目标蛋白很少，很大可能是由于蛋白洗脱不完全。

为进一步确认是否为蛋白洗脱不完全，可取少量洗脱后的磁珠，加入1×SDS Loading buffer，95℃加热5-10min，SDS-PAGE胶检测是否有目的蛋白条带。若有，则代表目的蛋白洗脱不完全（或几乎未洗脱下来）。

原因1：洗脱条件太温和

解决方案：

1）提高洗脱液中的竞争洗脱成分（eg.增加咪唑浓度）

2）增加洗脱液中离子强度（例：NaCl浓度），以降低蛋白间相互作用

3）增加洗脱体积

4）延长洗脱时间

5）调整洗脱溶液的pH （eg. His可降低pH至4.0，GST可调整到8-9）

6）洗脱成分失效（eg.GST蛋白洗脱液需现用现配）

原因2：非特异性疏水吸附或沉积（尤其针对水溶性差的蛋白）

解决方案：

1）裂解、洗涤、洗脱液中添加0.5%-2%的Triton X-100或Tween-20

2）裂解、洗涤、洗脱液中添加1-2M尿素（蛋白不会变性）

3）以上两种方法都不能使蛋白洗脱，可加4-8 M 尿素，或4-6 M 盐酸胍使蛋白变性洗脱。

原因3：蛋白间形成聚集（针对具有丰富二硫键的蛋白）

解决方案：

缓冲液中加入1-2mM DTT或1-5mM巯基乙醇

注：针对有大量蛋白沉积的磁珠，需要用0.5M NaOH或4-8 M 尿素（或4-6 M 盐酸胍）清洗磁珠、再生。

实际案例：

利用BeaverBeads™ Magrose Strep-Tactin（Cat.#70808）纯化水溶性较差的Strep-tag II标签蛋白。初步实验，发现洗脱液中无目的蛋白。但洗脱前的磁珠和HABA再生后的磁珠，跑胶显示都有目的蛋白，此外，即使HABA再生也不能将目的蛋白从磁珠上洗脱下来，证明蛋白沉积在磁珠上。

图1：初步实验纯化效果。红框区域为目的蛋白区域，beads before elution:洗脱前的磁珠，beads after HABA:HABA再生后的磁珠，Elution:洗脱产物。

调整实验条件，将裂解、洗涤和洗脱液中分别添加1%的Triton X-100后，磁珠结合与洗脱效率都得到很大提升

图2：改进后各步骤的SDS-PAGE结果。红框为纯化后的目的蛋白区域。

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