手把手教你工具病毒的注射方法（下）

自注射方法系列软文推出以来，受到了广大老师的关注和好评，也发现了老师们实验中不同注射方法的需求，本期我们也响应多位老师的呼声，给大家整理了工具病毒感染心血管、肾脏的常用注射方法（注：尾静脉注射操作方法已在《手把手教你工具病毒的注射方法（上）》中介绍，本文不再赘述）。

心血管主要由心脏和血管组成，在使用工具病毒感染心脏或血管时常用的注射方法主要有尾静脉注射、心肌定点注射、心包内注射、血管夹闭注射等，具体操作方法如下：

心肌定点注射

1. 实验前准备

准备内容：常规手术器械、静脉留置针、气管插管、10ml注射器、缝合线、剃毛器、呼吸机、体重秤、微量注射器、干棉球、1%的戊巴比妥、胰岛素注射针、小鼠、病毒、碘伏、75%酒精、金霉素眼膏、PBS；

a. 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b. 固定：待小鼠完全麻醉后，将其固定在操作台面，用门齿环固定头部，眼部涂抹金霉素眼膏以保持湿润。

2. 心脏暴露及固定

a.使用镊子将小鼠舌头拉出，然后用耳镜找到声带，并引导导丝通过声带进入气管，而后在导丝的引导下将导管置入气管内；

b.抽出导丝，利用10ml注射器吹气观察肺部变化，确定插管放置位置准确，而后用缝合线将导管固定；

c.使小鼠处于左侧卧位，将气管内插管与呼吸机连通；

d.剔除胸部偏左部位的毛发，用酒精和碘伏依次消毒，盖上手术布，确保手术部位无菌；

e.在第四肋间隙做一个2厘米的皮肤切口，分割皮下组织和肌肉肌肉，通过第四肋间隙进入胸腔，观察左膈神经，在不破坏神经的情况下打开心包，露出左心室。

3. 病毒注射

a. 穿过左心室尖端放置一根7–0聚乙烯缝合线，并用一对止血钳夹住缝合线的两端；

b. 用胰岛素注射针吸取适量病毒载体，用优势手拿胰岛素注射器；

c. 用非优势手抓住缝合线操控心脏位置，使得最大程度暴露左心室注射位点；

d. 将胰岛素注射器针头插入心肌，回抽确认无回血后注射适量病毒，然后依次注射其它位点（一般3~5个位点，保持位点间距相等，每个位点注射量约3μl）；

e. 注射结束后，将18号的静脉留置针穿过皮肤并经第五和第六肋间隙进入胸腔，抽出针头。

4. 动物复苏

a. 依次缝合肋间隙、肌肉组织、皮下组织、皮肤；

b. 皮肤缝合后，将静脉留置针与10ml注射器相连，拉出活塞至拉动受阻，保持活塞位置，将静脉留置针和注射器移走；

c. 待小鼠恢复自主呼吸后，关闭呼吸机撤掉气管内插管，并将大鼠从操作台上取下放入饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。

注意事项

a. 手术后4h和12h注射消炎止痛药，防止动物因疼痛而抓挠伤口致使开线或伤口感染;

b. 病毒种类不同，其感染扩散范围不同，要根据注射病毒类型选择合适的注射位点数。

心包内注射

图1. 心包结构示意图

1. 实验前准备

准备内容：新生鼠、250ul注射器、33号针头、微套管（内径0.51mm，外径1.53mm）、病毒、冰、无菌生理盐水或PBS、培养皿；

a. 装置准备：在33号针头上距尖端3mm位置以上位置用微套管覆盖；

b. 麻醉：将幼鼠从笼内取出，放入培养皿后置于冰上2~3min，使其麻醉。

2. 病毒注射

a. 吸取病毒：用微量注射器吸取足量的病毒，而后更换准备好的33号针头并轻推排出气体，放冰上备用；

b. 抓取幼鼠：用非惯用手的拇指和食指捏住幼鼠颈背部皮肤，翻转手腕使幼鼠腹部朝上，确保能清晰看到胸骨、肋骨和剑突；

c. 注射：用惯用手持微量注射器，自左肋骨剑突角下针，而后将针头向上沿与左肋骨边缘平行方向推进3mm（至套管处）停止，缓慢注射50μl病毒液至心包腔，而后缓慢将针拔出。

3. 动物复苏

将幼鼠放回原鼠笼母鼠身边，采取适当保暖措施帮助小鼠恢复。

注意事项

a. 病毒注射时进针操作要轻柔，避免用力过大损伤幼鼠其它脏器或进针过深；

b. 病毒注射完毕，必须要立即采取保暖措施，确保幼鼠体温快速恢复。

血管夹闭

图2. 血管夹闭示意图

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、常规手术器械、缝合线、剃毛器、体重秤、微量注射器、干棉球、1%的戊巴比妥、胰岛素注射针、碘伏、75%酒精、双氧水、金霉素眼膏、PBS；

a. 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b. 固定：待小鼠完全麻醉后，将其固定在操作台面，用门齿环固定头部，眼部涂抹金霉素眼膏以保持湿润。

2.血管暴露

a. 使用镊子将小鼠舌头拉出，确保气道顺畅，并将大鼠头适当向右偏转；

b. 用剃毛器将大鼠左侧颈部毛发剔除，用酒精、碘伏、双氧水依次擦拭皮肤消毒；

c. 在颈部偏左位置做一个3cm切口，分离皮下组织、肌肉等，用止血钳拉开皮肤，暴露出左侧颈动脉。

3. 病毒注射

a. 确定好感染目标节段，分别在其远心端和近心端各夹一个止血夹（根据流向先夹上游），确保血流完全阻滞；

b. 用胰岛素注射针吸取适量病毒（约50μl），而后将病毒缓缓注入夹闭的血管节段，30分钟后拿掉止血夹，恢复血液流通。

4.动物复苏

a. 先使用可吸收的4-0缝合线缝合肌肉，然后用5-0缝合线依次缝合皮下组织和皮肤；

b. 将小鼠放回笼内（可在旁边放置加热器），待其苏醒。

注意事项

a. 手术后4h和12h注射消炎止痛药，防止动物因疼痛而抓挠伤口致使开线或伤口感染；

b. 血管夹闭时间越长病毒感染效果越好，但对下游组织的损伤也越严重，因此夹闭时间不宜超过半小时。

肾脏组织病毒感染常用方法有尾静脉注射、肾脏定点注射、肾盂注射，具体操作方法介绍如下：

肾脏（实质）定点注射

图3. 小鼠肾脏结构示意图

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、1ml注射器、10μl微量注射器、1%戊巴比妥钠麻醉剂、无菌生理盐水、75%酒精、碘伏、棉球、剃毛器、常用手术器械、加热装置等；

a.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b.剃毛：待小鼠进入完全麻醉状态后，用剃毛器剃除掉小鼠背部毛发，暴露背部皮肤；

c.固定：用胶带将小鼠俯卧位固定于手术台面上，将小鼠头部一侧偏斜，小鼠舌头拉至一侧嘴角，以防窒息，眼部涂抹金霉素眼膏保持湿润。

2.暴露肾脏

a. 以后正中线为中心，依次用碘伏、酒精对背部皮肤消毒，并铺上无菌手术布（留正中线肋弓下缘区域）；

b. 沿后正中线肋缘下做一长约1.0 cm的纵切口，依次切开背部皮肤、皮下组织、肌层，将切口左右水平分离，可见一侧肾脏区域；

c. 用止血钳沿肾门小心分离肾周组织，避开血管和输尿管，暴露肾脏；

d. 将弯头镊置于肾脏下方，轻轻托起肾脏至切口外，使之固定于切口皮肤处。

3.病毒注射

a. 根据感染目标选择注射位点：全肾感染的话一般在肾脏的上下前后位置选择4个位点，局部感染则可选两个位点；

b. 用微量注射器吸取适当体积（~10μl）的病毒，按上述位点进针，进针深度以针头斜面刚好刺入肾组织即可（1~2mm），缓慢注射，注射完毕后短暂留针后再拔出；

c. 检查肾脏无异常后将其小心归位，同样操作完整另一侧肾脏注射。

4.动物复苏

a. 将肌层、皮肤依次用缝合线缝合，并用酒精对切口消毒；

b. 将缝合好的小鼠从手术台取下，放回饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。

注意事项

a. 注射病毒时操作要轻柔，避免用力过大插入肾盂；

b.不同病毒扩散范围不同，根据不同病毒的扩散能力适当增减注射点数。

肾盂注射

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、1ml注射器、10μl微量注射器、1%戊巴比妥钠麻醉剂、呼吸机、气管插管、无菌生理盐水、75%酒精、碘伏、棉球、金霉素眼膏、剃毛器、常用手术器械、加热装置等;

a. 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b. 剃毛：待小鼠进入完全麻醉状态后，用剃毛器剃除掉小鼠左腹毛发，暴露皮肤；

c. 固定：用胶带将小鼠仰卧位固定于手术台面上，通过气管插管连通呼吸机，眼部涂抹金霉素眼膏以保持湿润。

2.暴露肾脏

a. 在左腹切开一个2cm的切口，依次分离皮肤、肌肉及周围组织，暴露左肾和输尿管；

b. 用止血夹夹住输尿管上段（阻止注射的病毒液下流至膀胱）；

c. 根据小鼠肾脏大小，确定刺入肾盂但又不刺穿肾盂的距离，在30G注射针针头前段相应位置装上套管。

3.病毒注射

a. 将有套管的针头装在微量注射器上，吸取约50ul病毒原液；

b. 将针头缓缓刺入肾脏至套管深度停止，缓慢注入病毒，停留片刻后轻轻拔出针头；

（若双肾注射，右肾按上述同样步骤注射）

c. 约5min后移去输尿管上的止血夹。

4.动物复苏

a. 将肌层、皮肤依次用缝合线缝合，并用酒精对切口消毒；

b. 撤掉气管插管，将缝合好的小鼠从手术台取下，放回饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。

注意事项

a. 进针时操作要轻柔，避免暴力操作导致肾脏出血损伤；

b. 套管位置刻度要提前做预实验确定，保证不刺穿肾盂。

最后，对以上注射方法特性总结如下：

靶向器官

注射方法

优势不足

心血管

心肌定点注射

病毒用量小，特异性感染注射位点心肌细胞

操作要求高，

动物损伤大

心包注射

操作简单，特异性好

注射准确度不好掌握

血管夹闭

感染效率高，特异性好，病毒用量小

操作要求高，动物损伤大，适用血管有限

尾静脉注射

操作简单，无损伤

病毒用量大，

特异性差

肾脏

肾脏定点注射

病毒用量小，特异性感染肾皮质

操作要求高，

动物损伤大

肾盂注射

病毒用量小，特异性感染肾盂、肾小管等

操作要求高，

动物损伤大

尾静脉注射

操作简单，无损伤

病毒用量大，

特异性差

其他注射方法详见：

呼吸系统病毒感染常用注射方法神经系统病毒感染常用注射方法

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