Cell:磷酸化蛋白组揭示新冠肺炎感染新机制

2019年持续至今的新冠肺炎（COVID-19）大流行，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的病原体已感染全球数千万人并杀死了上百万人，这凸显了迫切需要开发抗病毒疗法。到目前为止，广谱抗病毒药物remdesivir是美国食品和药物管理局（FDA）批准的唯一可紧急用于治疗COVID-19的药物。尽管remdesivir在晚期COVID-19患者中被证明有效，但仍然迫切需要有效的SARS-CoV-2治疗剂，尤其是那些在门诊就可以有效治疗COVID-19的药物。

蛋白质组学方法可通过定量反映感染后细胞的生命活动进程，从而全面阐明蛋白质丰度和磷酸化的变化，是阐明新冠病毒发病机理的强大工具。采用最先进的生物信息学方法从磷酸化谱中轻松识别受调节的激酶，其中许多可能已被确定为具有治疗潜力的药物靶标。今年Mehdi Bouhaddou等科学家发表在《Cell》上的一篇文章通过蛋白组跟磷酸化蛋白组联合分析的方法揭示了COVID-19的发病机制，并确定了具有治疗SARS-CoV-2有潜力的药物和化合物。

作者通过收集对SARS-CoV-2敏感性高的Vero E6细胞进行了磷酸化蛋白质组学实验，SARS-CoV-2感染不同时间收集细胞，采用DIA蛋白质组学方法对每个样品进行区分并分析总体蛋白丰度或磷酸化的变化。结果发现在感染过程中观察到调节的磷酸化位点和蛋白质的数量显著增加，大部分调节发生在磷酸化水平，而不是蛋白质丰度。这表明磷酸化信号代表了感染这一时间过程中的主要宿主反应，而不是转录调节（图1）。

  图 1

宿主细胞内的病毒蛋白磷酸化在感知和响应细胞状态中发挥重要作用，其关键在于磷酸化位点。作者通过结构生物学手段鉴定出了膜（M）蛋白Nsp9和核衣壳（N）蛋白磷酸化位点，并解析了他们的作用机制（图2）。

图 2

最近发表的SARS-CoV-2病毒-人类蛋白质-蛋白质相互作用图谱鉴定了332种人类蛋白质与27种（26种野生型和1种突变型）病毒蛋白质相互作用。在这里，作者发现其中一些宿主蛋白（332个中的40个）在感染后磷酸化差异显著（图3）。病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用可通过影响宿主蛋白亚细胞来驱动磷酸化定位的改变或空间阻断激酶的访问。

图 3

为了研究激酶信号传导的整体变化及其对宿主蛋白质磷酸化的影响，使用数据驱动的聚类方法，根据其动态将受调控的磷酸化位点分为五个簇（STAR方法）。对于每个组，都对功能和途径进行了富集分析。对97种激酶进行分析，发现激活最强的激酶是p38途径的几个成员，他们可抑制Rho信号传导；预计被下调的激酶包括几种细胞周期激酶（CDK1 / 2/5和AURKA），细胞生长相关的信号通路激酶（PRKACA，AKT1 / 2，MAPK1 / 3和PIM1）以及细胞骨架调节剂（PAK1）等。将激酶活性与下游蛋白质复合物联系起来，确定了上调或下调的磷酸化位点的富集（图4）。

图 4

磷酸蛋白质组学数据表明在SARS-CoV-2感染后存在与细胞骨架组织有关的几种激酶和效应蛋白的调节。发现Rho / Rac / Cdc42 GTPases（PAK1 / 2和ROCK1 / 2）下游的激酶以及波形蛋白（VIM S39和S56）和stathmin（STMN1 S16和S25）中PAK1 / 2激酶的几个特征明确的磷酸化位点靶标在感染期间被下调（图5）。SARS-CoV-2感染引起丝状突起急剧增加，与未感染的细胞相比，丝状突起明显更长，分支更多，沿着这些丝状伪足清晰可见可见组装的病毒颗粒。在24小时后，被感染的细胞显示出沿薄丝状突起的CK2表达，且与SARS-CoV-2 N蛋白部分共定位。

图 5

SARS-CoV-2磷酸化谱的激酶活性分析预测了p38 /促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的几个成分的上调，包括MAP2K3，MAP2K6，MAPK12，MAPKAPK2（MK2）和MAPKAPK3。此外，磷酸化蛋白质组学数据还显示p38途径底物（例如负延伸因子E（NELFE），热休克蛋白beta-1（HSPB1），信号转导子和转录激活因子1-alpha / beta（STAT1）等的磷酸化增加。还通过一系列实验研究了p38 / MAPK途径对细胞因子产生的贡献。将SARS-CoV-2感染细胞的磷酸化蛋白质组学图谱与在特定细胞周期阶段收集的磷酸化谱图数据库进行比较，病毒感染与S / G2转换停滞的细胞高度相关，与有丝分裂中的细胞谱负相关（图6）。

图 6

为了确定针对SARS-CoV-2感染的有效疗法，将激酶抑制剂定位到调节最差的激酶活性和特定的磷酸化位点（STAR方法）。结果列出了87种药物和化合物：10份FDA批准的药品，53份正在进行临床测试的药品和24份临床前药品。针对CK2、p38 MAPK信号，发现化合物或药物Remdesivir、Silmitasertib、gilteritinib、ralimetinib都具有一定的抗病毒效果。同时作者还发现，调节磷脂酰肌醇酶活性的PIKFYVE的一种小分子抑制剂及针对CDK抑制剂dinaciclib在两种细胞系Vero E6和A549-ACE2中都具有强大的抗病毒效果。

图 7

磷酸化蛋白质组学方法探究了SARS-CoV-2感染期间宿主细胞的生命活动进程。为了满足对抗COVID-19的改良治疗策略的需求，作者采用了数据驱动的方法，将失调的信号通路的磷酸化图谱映射到靶向这些信号通路的药物和化合物。希望将来可以采用这种范例寻找针对COVID-19和其他传染病的疗法。

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