你们要的高效转导的『内皮细胞特异性AAV』来了！

脉管系统中的血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells）参与许多生理过程如血管通透性、血管生成、炎症，以及病理相关如动脉粥样硬化、高血压、缺血性心脏病、糖尿病性微血管病、血管炎、血栓栓塞性疾病和癌症。因此，基于EC的基因治疗前景广阔。

然而，转胞吞作用、EC的定期更换和丰富的细胞外基质限制了EC转导效率，有效的基因递送手段对于EC研究显得十分重要。重组腺相关病毒（rAAV）是目前基因治疗最有吸引力的工具，它能够转导分裂和非分裂细胞，引发有限的免疫应答，以及赋予转基因长期表达的能力。 

先前的研究主要利用rAAV血清型2。如Chang¹在后肢缺血的大鼠模型中，运用rAAV2在动脉内递送血管内皮生长因子（VEGF），并且报道了新的侧支血管的显著增加及肌肉氧张力改善。但问题是血管细胞的转导效率相对较低，因此本文从rAAV技术出发，基于血清型及启动子两个角度改善对EC细胞的基因递送。

Birmingham²构建报告系统验证AAV1-5常规血清型对EC细胞在in vivo和 in vitro的感染情况，结果显示：AAV1和AAV5对EC感染能力较强，AAV5最优，但存在表达延迟现象:

ELISA测定不同血清型AAV转导大鼠主动脉内皮细胞（RAEC）基因表达水平

用AAV1,2,5血清型载体转导大鼠主动脉区段并以荧光素酶进行检测。rAAV1（ B ），rAAV2（ C ）和rAAV5（ D ），箭头表示EC的阳性染色

以上结果表明:使用rAAV血清型1和5用于血管靶向的基因递送有显著优势，但上述血清型还会对平滑肌及其他脏器有着较强的感染效率，限制了其在基因治疗上面的进一步应用。

在体动脉内递送rAAV脱靶的组织主要为：血管介质中的平滑肌细胞、肝脏等器官（AAV天然靶向且血液流向集中）；Nicklin³通过噬菌体展示分离技术，在2型AAV上插入了EC靶向肽SIGYPLP，命名为AAVsig，与传统2型相比，AAVsig对脐静脉内皮表达增加约5.9倍，对隐静脉内皮细胞增加约28.2倍。

AAVsig介导增强的EC基因转移。用增加剂量的AAVwt或AAVsig感染EC并分析β-半乳糖苷酶表达。（A）人脐静脉内皮细胞HUVEC。（B）人隐静脉内皮细胞HSVEC

除了对所需细胞类型的增强趋向性之外，Nicklin还验证了AAVsig对平滑肌及肝细胞的表达情况，结果显示，AAVsig比野生型具有对EC细胞更强的靶向性（bafilomycin A2试剂能额外增强AAVsig对EC细胞的感染）。

低、高剂量的AAVwt或AAVsig感染人原代血管平滑肌细胞（A）或HepG2肝细胞（B）于72小时表达情况

发表于Nature的另一篇文章采取相同的策略，在rAAV9衣壳A589位点插入两种七肽RGDLRVS和SLRSPPS，以流式筛选荧光确认感染效率，并论证两者对EC感染情况：

冠状动脉内皮细胞（HCAECs）；人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）；肝肾等来源的永生化细胞（HEK293T，HeLa，911，HepG2）

数据显示，rAAV9插入肽有效地提升了对EC细胞的感染效率，但不具有EC靶向性，作者的出发点是：AAV9比AAV2在人体含有更低的免疫原性，可以逃避中和抗体，增加临床应用可行性（文章最后选定SLRSPPS，具体数据本文未显示）。

病毒、免疫球蛋白（IVIG）或ADK9（衣壳结合AAV9抗体）、293细胞共孵育，以流式筛选EGFP阳性细胞，突变体SLRSPPS和RGDLRVS分别显示出比wtAAV9，wtAAV2或AAV2-NDVRAVS 更好的体外抗体逃逸约4倍和8倍：

横坐标表示稀释倍数，纵坐标表示被中和的百分比

对于脑部及脊髓中枢神经系统（CNS）的EC递送更加有挑战性。新型的AAV-BR1血清型同样基于外壳改造，获得了脑部内皮靶向的专一性，而且还具有尾静脉注射的便利性。作者依靠BR1血清型在尿失禁性黄疸（IP）小鼠模型上减弱了该CNS遗传性疾病，并展望了用于治疗其他的神经系统疾病⁵。

不同AAV尾静脉注射荧光成像图

人细胞间粘附分子2（ICAM-2）表达局限于血管内皮细胞和巨核细胞，Cowan⁶鉴定了该基因0.3k的启动子，并验证了其EC特异性（展示部分数据）：

荧光素酶报告验证的ICAM-2表达活性

BAEC牛主动脉内皮细胞，COS猿猴肾成纤维细胞系

另外一种内皮特异性启动子来源于酪氨酸激酶受体TIE1/2基因，与ICAM-2调控原理类似，三种启动子在内皮的特异性主要由PEA3基序决定：

TIE启动子内部的PEA3基序

Korhonen⁴使用TIE启动子构建β-半乳糖苷酶系统（染色验证）转基因小鼠，并验证了启动子表达分布（展示部分数据）：

B：表达限定于大血管的EC，心内膜（箭头）只有弱阳性

D：肝脏中只有少数小动脉表达（箭头）

除BR1静脉注射，常规病毒多以区段动脉注射为主（为的是隔离脏器），内皮细胞的在体AAV注射主要步骤为：

以下截取文章部分注射流程（更多详情见文章）：

腹主动脉的肾下段在麻醉下（2.5％异氟烷）通过中线切口暴露，夹在肾动脉正下方，血管插管引入分离的血管段，主动脉用生理盐水冲洗。 用rAAV1，rAAV2或rAAV5-Luc-EYFP（20μl，1×10¹³病毒颗粒/毫升）或等体积的盐水（每组n = 3）在腔内转导该区段。 使病毒在主动脉中停留30分钟，然后取出插管并缝合切口。 转导后3周处死大鼠，并通过免疫组织化学分析转基因表达²。

左颈动脉通过中线颈部切口暴露; 用局部利多卡因1％（Lidocain; Orion）避免血管痉挛，无创伤血管夹之间分离1.5至2.5厘米的颈动脉段，并通过近端和远端动脉切开术将两个24号Neoflon套管引入管腔。通过用0.9％盐水温和冲洗使血管腔清除血液，并将约100μl含有或不含有40μMMG-132或相同体积的0.9％盐水的AAV2-CMV-EGFP-WPRE病毒滴入容器腔并原位停留20分钟。 在孵育期后，用0.9％盐水冲洗血管腔，使用缝合线修复，并通过移除夹子恢复血流⁷。 

综上所述，结合改造血清型+特异性启动子是最优AAV感染EC的方式，吉凯基因为EC研究者倾情奉上所述AAV试用装，期待您的参与！！！

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