视频教程∣CRISPR-Cas9基因敲除，从sgRNA设计开始！

CRISPR-Cas9作为新一代的基因编辑技术，在基因功能研究、模式动物构建、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。

该技术的原理是小向导RNA（sgRNA）引导cas9蛋白靶向基因组特定位点进行基因编辑。sgRNA序列特征、设计位置对于敲除的有效性及基因功能变化至关重要，那么sgRNA到底是如何设计的呢？

①Spcas9为20bp+NGG；Sacas9为21bp+NNGRRT

②避免出现连续4个及以上的T—终止信号

• GC含量：40%~60%

• 靶点位置  ：

①必须设计在CDS区 

②设计在独立外显子，尽量靠近蛋白N端（编码区前三分之一） 

③不宜紧邻翻译起始密码子，避免翻译从下游ATG开始；多个靶点之间序列不重叠，避免snp影响靶点有效性

• 特异性：

①默认针对同源区设计 

②在基因组其他位置至少错配三个碱基

从NCBI获取关键信息：Genbank ID、转录本之间的同源性。

在NCBI主页GENE界面输入“基因名称”、“物种”，搜索对应的基因。以人源NLE1为例，输入“NLE1 human”搜索。下拉至“Genomic regions, transcripts, and products”，可以看到转录本信息Genbank ID（共计3个转录本），此ID与序列对应，可在核酸界面查询序列。

Genbank ID命名规则如下：

NM,XM--编码类型转录本（NM为认证的，XM属于预测的）

NC,NG,AC等--基因组类型

NR,XR--非编码转录本（NR表示认证的，XR表示预测的）

AK,AF等命名--看注释，大部分为文章的作者提交的序列

Genbank ID对应的横线表示前体RNA

竖形方块表示外显子

浅色方块表示UTR

深色方块表示编码区

每个Genbank ID共有的方块即为同源区

选择同源编码区外显子，如NLE1基因NM_001014445和NM_018096，NM_018096从第一号外显子即编码，而NM_001014445从第7号外显子才为编码区，因此， NM_001014445的第七号外显子设计才是同源区。

需要注意的是，如果同源编码区位置太靠后，势必会造成某些转录本实际敲除区域也靠后，那么功能是否会有残留呢？如NLE1同源区设计的靶点对于NM_018096转录本而言位于蛋白末尾的三分之一，如果N端过多的蛋白依然有功能，就得设计多套靶点共同感染细胞，不同靶点分别敲除不同转录本达到基因功能缺失的目的（是否有功能残留需要了解目的蛋白的结构域特征—可通过文献或者uniprot蛋白数据库查阅）。当然，如果想特异性敲除某一转录本，可针对非同源编码区设计（如NM_018096第一至六号外显子设计的靶点不会影响NM_001014445蛋白）。

以snapgen软件打开NM_001014445，复制第七号外显子的编码区，软件操作见视频。

打开张锋CRISPOR设计网站，点击“CRISPOR”，进入信息填写页面：

Step1：添入待设计靶点的序列；

Step2：选择对应物种，可搜索如mouse；若出现多个选项，可默认选择带有年份及年份较新的子数据库；

Step3：选择对应的cas9类型，最常见的是spCAS9，其次为saCAS9，根据类型选择对应的即可。

信息填完整之后点击“submit”，出现结果页面：

结果界面显示：位置、序列、特异性评分、有效性、脱靶等众多参数；网站排序以特异性评分为基准排序，也就是排序靠前的为综合评分较好的。常规“MIT Specificity Score”及“CFD Spec. score”都大于70算较优的靶点；至于有效性可以依靠设计多个靶点规避无效的情况；脱靶率较高是cas9常见问题，功能实验补个回复实验（详情参考：你的RNAi文章为什么被驳回）则完全可以cover技术短板及审稿人的疑虑。

虽然网站给出了特异性评分这一项，但自行与基因组比对还是有必要的。

打开BLAST主页，直接在“BLAST Genomes”处选择或者搜索对应物种，点击“search”，此处以“human”为例：

下一步填入靶点序列即可，点击blast：

Blast结果界面分析同siRNA教学，“Max score”匹配值唯一：即输入的碱基数乘以2，与染色体完全匹配的只有一个（此处输入20bp，完全匹配值只有一个40.1；第二匹配值为32.2，表示只有16个碱基配对，为四个碱基错配—表示特异性OK）

严谨的读者指出：唯一匹配项如果不是针对目的基因怎么办？

下拉至Alignments第一个完全匹配的结果，看染色体编号以及位置（已标出）：

回到NCBI-GENE界面，“Genomic context”区同样的信息，若前者包含在对应的基因区域，那么靶点就是座落在该基因的。

以上即sgRNA靶点设计及比对的流程，设计2~3个靶点进行验证，更加有利于筛选出有效靶点。

今天的靶点设计，你学会了吗？！或许你还想关注SiRNA的靶点设计：SiRNA设计从入门到精通，教会您如何筛选有效靶点！有空就一起学一下吧！

附：

NCBI基因查询

NCBI核酸序列查询

Cas9设计

NCBI-Blast

Snapgene软件下载

蛋白数据库

讲

师

介

绍

陈建儒，吉凯基因工具病毒产品售前技术专家；从事载体构建相关工作5年有余，熟悉各类核酸数据库及核酸相关的分子设计、预测；录制过诸多基因操作软件和网站使用的课程，被广大用户一致评价为“实用性极强、简单易学”！

 

接下来陈老师的以下课程将会与大家见面，如果您对课程感兴趣，想进一步进行技术交流，欢迎添加微信号，获得陈老师的1V1指导哦~~

1.如何查找基因序列？

2.如何设计引物？

3.如何设计RNAi/CRISPR靶点？

4.如何预测miRNA靶基因/miRNA结合位点？

5.如何预测转录激活因子结合位点？