项目文章|Environ Int.,复旦大学重点实验室对短期接触空气细颗粒物污染对尿液代谢组的影响研究（2）

PM2.5是空气中的超细悬浮粒子之一，其最直接的副作用是造成雾霾天气，从而影响人体健康，甚至有引发各种并发症的风险，所以目前环境问题的重视不容小觑。本篇由鹿明生物合作客户于2019年5月，复旦大学的公共卫生安全重点实验室和教育部和卫生技术重点实验室在Environment International杂志（IF=7.943）发表的题为“短期接触空气细颗粒物污染对尿液代谢组的影响：一项随机、双盲、交叉试验”的研究论文，该文章是使用LC-MS代谢组学技术探索环境颗粒污染物对人体健康不良影响系列研究的第二篇论文，作者进行了尿液代谢组学和细颗粒物（PM2.5）暴露相关的研究，并探索了PM2.5空气污染对健康影响的生物学机制。

英文标题：Impact of short-term exposure to fine particulate matter air pollution on urinary metabolome：A randomized, double-blind, Crossover trial

中文标题：短期接触空气细颗粒物污染对尿液代谢组的影响：一项随机、双盲、交叉试验

材料：尿液

影响因子：7.943

发表期刊：Environment International

运用鹿明生物技术：UPLC-MS普筛

细颗粒物（空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物，PM2.5）是人类多种疾病的重要危险因素，但其潜在机制尚未阐述清楚。已研究表明，全身性炎症和氧化应激是PM2.5对心肺健康影响的主要生物学途径。一些研究发现了与炎症和氧化应激相关的代谢产物（包括花生四烯酸、乳酸和谷胱甘肽）也与心肺疾病有关。

我们知道近十年来代谢组学已成为一种有效的方法，可对环境中的毒性物质进行整体地表征和定量分析，一些研究已表明PM2.5短期暴露会显著影响血清或血浆代谢谱。作为无创取样的体液，尿液也常用于代谢组学研究。作者之前进行的空气净化随机交叉试验发现，健康年轻人血清代谢物的显著变化与下丘脑-垂体-肾上腺和交感-肾上腺髓质轴的活化有关（文献1）。由于尿和血液代谢组对外部毒性的反应可能不同（文献2），因此作者在同一人群中也进行了尿液代谢组学分析，以探讨与短期PM2.5暴露相关的潜在代谢紊乱机制。

1.实验分组

2015年11月至12月在中国上海对60个健康大学生进行随机-双盲交叉实验。该研究方案（图-引用）在ClinicalTrials.gov（临床试验标识符为NCT02712333）注册，并得到了复旦大学公共卫生学院审查委员会的批准。所有参与者在注册时均提供了书面知情同意书。具体做法是：将真假空气净化器随机放在测试者的宿舍9天，34个测试者使用了真净化器、其中31人完成实验并进行第一次健康评估，26个志愿者使用了假净化器、其中24人完成实验并进行第一次健康评估。合计55名（男28名，女27名）完成了实验。在12天的清洗期后，将真假净化器进行交换，并随后进行第二次健康评估及样品收集。在每种情况下的最后一天收集第一批尿样（清晨尿液），并储存在-80℃的冰箱中，在室温下解冻进行代谢组学分析。两个阶段结束时共收集到45名（男27名，女18名）尿液样本，参与者的平均年龄和体重指数为20.2±1.4岁和21.3±2.8 kg / m²。表1显示了PM2.5浓度、温度和相对湿度的每日平均值。

图-引用（文献1）空气净化随机，双盲和交叉试验的流程图

表1 实际和假净化下的PM2.5浓度、温度和相对湿度的每日平均值

2.检测方法

（1）尿液代谢组学实验：UPLC-MS非靶标分析；

（2）数据处理：主成分分析、正交偏最小二乘判别分析

1.尿液代谢组分析结果

主成分分析（PCA）得分图（图1A）显示质量控制样品聚集紧密，表明UPLC-MS分析重复性很好。此外OPLS-DA的得分图（图1B）显示，真假净化方案的尿液样品可清楚地分离。

图1 | 分类模型得分图（A）PCA；（B）OPLS-DA

表2 与PM2.5暴露量（10μg/m³）相关的真假净化方案中脂质差异代谢物

表3 与PM2.5暴露量（10μg/m³）相关的真假净化方案中嘌呤差异代谢物

表4 与PM2.5暴露量（10μg/m³）相关的真假净化方案中其他差异代谢物

表4显示了与PM2.5暴露相关的神经递质代谢产物的变化。戊二醇是儿茶酚胺的代谢产物，随着PM2.5暴露而增加。辅酶及其相关代谢产物，包括N-甲基烟酰胺（NMN）、十四烷酮和减少的黄素单核苷酸（FMNH2），也随着更高的PM2.5暴露而增加（表4）。

作者在血清中检测到的15种重要代谢物（文献1）在本实验中也检测到了，尽管与PM2.5暴露的变化方向一致，这些尿液代谢产物的变化在本研究中均无统计学意义。

2.PM2.5暴露与能量代谢

尿液代谢组学结果表明，短期暴露于PM2.5可能会影响能量代谢，这可能会诱导产生ROS并导致其他后果，例如膜损伤、氧化应激和炎症（图2）。有证据表明，与能量代谢（例如乳酸）和氧化应激（例如谷胱甘肽）有关的代谢产物可用于识别高危患者并预测呼吸系统疾病的结果，这与作者之前的研究结果一致。作者之前的研究结果显示4种酰基肉碱在PM2.5的高暴露下显著增加（文献1）。酰基肉碱通过将脂肪酸运输到线粒体中进行氧化和生成三磷酸腺苷（ATP），从而参与长链脂肪酸的β-氧化。该过程是脂肪酸氧化的速率限制因素，酰基肉碱的增加表明脂肪酸氧化不足。脂肪酸氧化也可能由腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）系统调节，该系统充当细胞能量供应的传感器，并可能随着AMP：ATP比值的升高而被激活。作者观察到在假净化方案的样本中AMP增加，这说明短期暴露于PM2.5可能影响细胞能量代谢。此外作者发现黄素单核苷酸（FMNH2）随着PM2.5暴露而显著增加。FMNH2作为呼吸电子运输链复合体1中的关键电子供体，参与磷酸化和ATP合成。因此它的增加可能表明对能量代谢扰动的ATP合成补偿性增强。作者还观察到在ATP能量不足的情况下，烟酰胺的甲基化产物N-甲基烟酰胺（NMN）也随着PM2.5暴露而增加。这些数据支持了PM2.5暴露可能是引起能量代谢紊乱原因的推测。

3.PM2.5暴露与氧化应激

作者研究结果表明，PM2.5暴露与氧化应激相关的代谢产物变化有关。次黄嘌呤、AMP和FMNH2升高，而磷脂、鞘氨醇和亮氨酸脑啡肽随着PM2.5暴露的增加而降低（图2）。次黄嘌呤是ATP和AMP的分解代谢产物，也是活性氧（ROS）的来源。高PM2.5暴露后FMNH2水平升高也表明过量形成ROS，这是呼吸电子运输链中的电子供体，也是限速因子，有助于超氧阴离子的产生。磷脂和鞘氨醇是细胞膜的重要组成部分，并受到ROS诱导的过氧化作用影响。研究发现磷脂和鞘氨醇减少，表明膜氧化增强。最后实验结果表明，内源性阿片样物质-亮氨酸脑啡肽随着PM2.5含量的升高而降低。亮氨酸脑啡肽被认为具有抑制中性粒细胞中超氧阴离子生成和中性粒细胞自发凋亡的抗氧化和抗炎作用。它的减少可能是由于在遇到外源氧化剂时体内抗氧化反应增强。

4.PM2.5暴露与炎症反应

香草二醇和6-酮-前列腺素F1α的增加以及棕榈酰乙醇酰胺的减少表明PM2.5暴露可能与炎症增加有关（图2）。据报导与炎症相关的代谢产物（例如花生四烯酸）与心血管疾病有关。棕榈酰乙醇酰胺通过激活核过氧化物酶体增殖物激活的受体α（PPAR-α）具有抗炎作用，可以减少中性粒细胞的流入并抑制促炎蛋白的表达。儿茶酚胺的代谢产物香草二醇的增加表明PM2.5可能刺激神经内分泌反应。这些结果与我们之前关于血清代谢组学的发现相一致，该研究表明PM2.5暴露后儿茶酚胺（包括肾上腺素和去甲肾上腺素）水平更高（文献1）。儿茶酚胺可通过刺激炎性细胞因子的合成和释放来调节免疫反应。此外6-酮基前列腺素F1α的增加支持了暴露于PM2.5后炎症反应的上调。该物质是前列环素的稳定代谢产物，是一种类花生酸，被认为具有血管舒张、抑制血小板活化和抗发炎的特性。作者对相同人群的研究还显示了炎症细胞因子和相关mRNA的表达上调。

5.PM2.5暴露与其它代谢途径

与血清代谢组学分析结果相比，作者发现与糖皮质激素、褪黑激素、儿茶酚胺以及脂质，氨基酸和嘌呤代谢有关的尿液代谢产物发生了一致的变化，尽管它们的变化并不明显。这些发现一致表明，短期暴露于PM2.5可能会引起应激反应并干扰脂质、氨基酸和嘌呤的代谢。尿液中代谢物的变化不太明显可能部分是因为尿液代谢物水平同时受代谢物血清浓度和肾脏排泄效率的影响，使人体内尿液代谢物水平的变化增强。

图2 | PM2.5暴露和能量代谢紊乱、氧化应激和炎症反应

6. 实验设计的优缺点的讨论

作者研究的设计有很多优点：首先，使用了随机、双盲、交叉试验设计模型，与观察研究相比，该模型具有更高的因果推理能力；其次，这是对健康大学生的研究，实验结果可能不会受到公认混杂因素（例如室内空气污染，吸烟，饮酒，用药和社会经济状况）的影响；第三，由于禁止烹饪和彻底清洁，因此室内的PM源可以忽略。

研究的局限性：首先，由于只招募了健康、不吸烟的年轻人，因此作者的发现可能对其他人群，尤其是老年人或患有心血管或呼吸系统疾病人群的推广性有限；其次，根据室内和室外测量时间加权来计算个人PM2.5暴露量，可能导致暴露量分类错误，不过由于参与者在两种情况下花费时间相近，这种分类错误应该是无差别的；第三，没有测量室内气体污染物的浓度。但是由于在两种情况下所有宿舍的布置都相似，并且所有净化器都安装了活性炭过滤器，以去除挥发性有机化合物（VOC），所以预计室内气体污染物的排放较低。此外由于作者使用了交叉设计，因此可以各种方案之间平衡气态污染物的影响。第四，作者没有为参与者测量尿液代谢物的基线水平，也没有控制饮食中的饮食影响。但是由于所有参与者均作为本研究的对照，基线代谢物水平或饮食习惯的不平衡不太可能导致实验结果的偏差。最后由于预算有限，样本量很小，作者发现需要在较大规模的研究中进行验证。

这项采用空气净化器的随机，双盲，交叉试验中真空气净化场景下的时间加权个人平均PM2.5暴露量比假净化场景下的暴露量（28.3μg/ m³ VS 56.9μg/ m³）低50％。作者观察到了与PM2.5暴露相关的尿液代谢产物的显著变化，共鉴定出40种变化显著的尿液代谢物，包括16种脂质、5种嘌呤代谢物、2种神经递质和3种辅酶。这些代谢物的变化表明，短期暴露于PM2.5可能导致尿中代谢组学特征发生重大变化，这可能进一步导致能量代谢，氧化应激和炎症的紊乱。作者的发现需要进一步的研究来证实，以全面理解人类代谢组应对PM2.5暴露的变化。

本文是第二篇应用代谢组学技术研究PM2.5暴露对人体健康影响的文章(项目文章| Circulation,IF=23.054复旦大学重点实验室发表颗粒物暴露与应激激素水平试验研究)，作者沿用了与第一篇文章（文献一）同样的实验设计，实验样本选择了尿液。尿液是容易采集到的体液样本，其中代谢物虽然少于血清，但仍然能获得很有意义的实验结果。这篇文章中，作者对采用的双盲、随机和交叉实验的优点和缺点做了进一步讨论，除了代谢组学实验结果以外，本文实验设计思路也非常值得借鉴。

本文系鹿明生物原创

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