双剑合璧！安徽农业大学高智谋团队运用组学“黄金组合”揭示棓丙酯抑制大豆疫霉菌机制

2020年7月安徽农业大学高智谋教授课题组在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊发表的题为 “Proteomics reveals the mechanism underlying the inhibition of Phytophthora sojae by propyl gallate ”的研究成果，通过蛋白质组学、CRISPR / Cas9基因编辑技术和代谢组学研究方法，探究了棓丙酯抑制大豆疫霉菌机理，为大豆疫霉菌的防治提供了理论依据。

大豆作为重要的经济作物，其主要病害的生物防治研究引起了研究人员的关注。大豆疫霉是一种严重的土壤致病菌，对其采取的主要控制措施包括诱导大豆抗性基因、使用杀真菌剂以及科学合理的种植管理。而不合理使用杀真菌剂会导致病原体产生抗药性，从而严重威胁食品生产过程的安全性。

据报道，大豆疫霉对甲霜灵、氟苯丙氨酸和苯甲酰等杀菌剂具有抗药性。因此筛选新的控制替代品非常重要。本文作者在初步研究中发现棓丙酯对大豆疫霉菌具有相当大的抑制作用，并且可以有效预防和治愈大豆疾病，但其潜在机制尚不清楚。为了探索棓丙酯对大豆疫霉菌的抑制机制，文章使用TMT蛋白质组学分析了棓丙酯预处理大豆前后的蛋白质谱差异。

1.实验材料

表型实验：

处理组中将棓丙酯水溶液添加到10％固体V8培养基中，最终培养基中棓丙酯的浓度为1和2 mmol/L。没有棓丙酯水溶液的培养基作为对照。在这些培养基中接种大豆疫霉菌，五天后观察到棓丙酯对大豆疫霉的抑制作用。

组学实验：

将棓丙酯的水溶液添加到20 mL的V8液体培养基中，使棓丙酯在培养基中的终浓度为1 mmol/L，在每种培养基中分别放入六个大豆疫霉菌培养皿。每种处理重复三次，每组重复十次。将培养皿置于25℃避光孵育三天后收获菌丝；除去琼脂块并用液氮冷冻以制备用于提取的蛋白质。

2.蛋白质组学分析

（1）TMT标记定量蛋白组学分析

对照组和棓丙酯处理组（1 mmol/L）的大豆疫霉菌，提取蛋白后进行TMT标记定量蛋白组学分析，每组3次重复。

（2）PRM靶向定量蛋白组学

随机选择15种差异表达蛋白进行PRM靶向定量验证

3. 功能验证

基因敲除：

CRISPR / Cas9基因编辑用于敲除PsFACL和PsCPT

脂肪酸代谢组学研究：

菌落直径为指标来评估脂肪酸代谢调控基因是否参与营养生长；感染斑直径和相对生物量指数用以测定大豆疫霉菌的毒力；GC-MS代谢组学用于测量脂肪酸含量。

1.棓丙酯抑制大豆疫霉菌的生长和感染

与对照组相比，经棓丙酯处理的大豆疫霉菌在固体培养基中生长缓慢，且当棓丙酯浓度达到2mmol/L时大豆疫霉菌难以生长（图1A）。为了获得蛋白质组学的研究材料，作者采用液体培养基培养，使用1mmol/L的棓丙酯处理大豆疫霉菌得到的湿重显著低于对照组（图1B）。培养48小时后，棓丙酯处理组样本颜色呈淡黄色（图1C）。此外，使用2mmol / L 棓丙酯溶液处理分离的大豆叶片和盆栽大豆，可有效抑制大豆疫霉感染（图1D和E）。

图1 | 棓丙酯抑制大豆疫霉菌的生长和感染

2.蛋白质组学质控和重复性评估

蛋白质电泳表明处理组和对照组均检测到大多数蛋白质，并且基本上相同。在25-55 kDa范围内具有一些表达量不同的蛋白质（图2A）。PCA分析结果表明两组间蛋白质表达谱可显著区分（图2B）。相对标准偏差的统计分析显示，对照组中三个生物学重复的相对标准偏差<0.6，处理组的相对标准偏差 <0.5，说明两组蛋白质样品具有良好的定量重现性。

图2 | 大豆疫霉菌样本的SDS-PAGE和PCA分析

3.蛋白质组学GO富集分析

GO富集分析结果见图3中。上调的差异蛋白富集了“核糖核蛋白复合物”，“细胞内核糖核蛋白复合物”和“核糖体”等细胞成分的条目（图3A）。下调的差异蛋白富集在“细胞外区域”和“细胞膜”的细胞成分条目中，以及“转运蛋白活性“、”跨膜转运蛋白活性”和“底物特异性转运蛋白活性”等分子功能条目。这些结果说明在棓丙酯处理下，大豆疫霉菌细胞膜养分转运减少（图3B），这也表明碳水化合物的利用可能受到不利影响。

图3 |差异表达蛋白的GO富集分析

4.蛋白质组学KEGG富集分析

KEGG分析显示（图4），上调的差异蛋白富集了“核糖体”、“糖酵解/糖异生”和“次级代谢产物的生物合成”的通路。下调的蛋白质主要富集在“酪氨酸代谢”、“苯丙氨酸代谢”，“泛醌和其他萜类醌醌的生物合成”、“次级代谢产物的生物合成”、“脂肪酸降解”、“淀粉和蔗糖代谢”、“糖酵解/糖异生”、“氰基氨基酸代谢”等代谢通路。

图4 | 差异表达蛋白的KEGG富集分析

5.PRM靶向验证

作者选取了15种蛋白质进行PRM靶向蛋白质组验证，并成功对其中的14种蛋白质进行了PRM定量。结果表明PRM靶向定量结果与TMT定量结果相一致（图5）。

图5 | 差异表达蛋白的PRM验证结果

6.PsFACL和PsCPT参与了大豆疫霉菌的生长

为了确认棓丙酯是否通过抑制PsFACL和PsCPT的表达来抑制大豆疫霉，作者敲除了PsFACL和PsCPT的相关候选基因。在进行gDNA PCR和测序筛选后，筛选了七个独立的敲除转化子突变体，并且随机选择了FACLT10，FACLT13，FACLT17，CPTT1，CPTT3和CPTT7作为后续测试材料。

野生型（WT）和敲除失败的转化子（CKFACL和CKCPT）转移到空载体中并用作对照。将它们接种在10％V8培养基中并观察其生长（图6）。结果显示转化子FACLT10，FACLT13和FACLT17的生长速度相对较低，菌落直径明显小于WT和CKFACL（P <0.05），这表明PsFACL参与了大豆疫霉菌的生长调节。而当PsCPT被敲除时也观察到类似的现象。敲除转化子CPTT1，CPTT3和CPTT7的生长速度显着低于WT和CKCPT（P <0.01），表明PsCPT也参与了大豆疫霉菌的生长调节。

图6 |不同大豆疫霉菌菌株的生长率差异

7. PsFACL和PsCPT参与了大豆疫霉菌的致病性调控

在接种不同菌株48小时后进行的脱色实验（decolorization experiments）中，大豆叶片上由转化体FACLT10，FACLT13，FACLT17，CPTT1，CPTT3和CPTT7引起的病变直径明显小于CKFACL和CKCPT转化子及野生型引起的病变直径（图7），表明PsFACL和PsCPT基因参与了大豆疫霉的致病性调节，并且该特性与其调节大豆疫霉的生长能力有关。

图7 | 大豆疫霉菌的毒力差异

8. PsFACL和PsCPT参与脂肪酸代谢的调节

候选基因PsFACL和PsCPT最有可能参与了脂肪酸代谢；Yousef等人[参考文献1]发现14C（14：0），16C（16：0），16C饱和（16：1ω7）和18C不饱和脂肪酸（18：1ω9和18：2ω6）是大豆疫霉的主要脂肪酸，它们占脂肪酸总含量的78％以上。作者在文章中测试了主要脂肪酸含量（图8）。结果显示，与野生型和CKFACL型相比，FACLT10、FACLT13和FACLT17中的六种脂肪酸的含量均有不同程度的降低。

图8 | 不同菌株的大豆疫霉菌中六种脂肪酸的含量

作者发现棓丙酯可以有效抑制大豆疫霉菌的生长和感染，为了探究相关机制，作者通过TMT蛋白质组学分析了棓丙酯处理前后大豆疫霉菌的蛋白质表达谱。结果在处理组中发现了75种上调蛋白和210种下调蛋白，差异蛋白的通路富集分析主要集中在糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸代谢和次生代谢产物通路。在这些差异蛋白中，包括PHYSODRAFT_522340和PHYSODRAFT_344464编码的两个密切相关的未表征蛋白，作者对其以PsFACL和PsCPT命名。CRISPR / Cas9敲除技术表明PsFACL和PsCPT参与了大豆疫霉菌的生长和致病性调节。

另外GC-MS代谢组学的结果表明，野生型（WT）和CRISPR / Cas9敲除转化体之间的脂肪酸水平存在差异。敲除PsFACL和PsCPT分别限制了长链脂肪酸的合成和β-氧化，这些结果提示PsFACL和PsCPT也参与脂肪酸代谢的调节。本文结果有助于理解棓丙酯抑制大豆疫霉菌生长的机制。

大豆疫霉菌是一种严重的土壤传播病原体，而其对常用杀菌剂的抗药性使得筛选新的替代品成为重要的研究方向。棓丙酯作为食品抗氧化剂具有良好的安全性，且本文作者发现棓丙酯可有效抑制大豆疫霉菌的生长和感染。作者使用蛋白质组学探索相关机制，对选出的差异蛋白PsFACL和PsCPT使用CRISPR / Cas9基因敲除技术进一步深入探索其对大豆疫霉菌生长和致病性的调控，发现并验证了其参与脂肪酸代谢的机制。作者的实验思路结合文献调研推导机制的过程值得借鉴和参考。

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部分参考文献：

[1] Yousef, L. F.; Wojno, M.; Dick, W. A.; Dick, R. P. Lipid profiling of the soybean pathogen Phytophthora sojae using Fatty Acid Methyl Esters (FAMEs). Fungal. Biol. 2012, 116(5), 613-619.

[2] Dong Liu et al. Proteomics Reveals the Mechanism Underlying the Inhibition of Phytophthora sojae by Propyl Gallate. J Agric Food Chem. 2020 Jul 23.

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