多组学研究 | 西南大学与佛罗里达大学合作发表柑橘黄龙病影响果肉风味的机制成果

2019年2月佛罗里达大学Frederick G. GmitterJr教授课题组在Horticulture Research发表了题为 “Proteomic and metabolomic analyses provide insight into the off-flavour of fruits from citrus trees infected with ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’”的研究成果，通过蛋白质组学和代谢组学研究方法，对被柑橘黄龙病菌感染的柑橘树果实进行了基于蛋白质和代谢物的代谢通路分析，探究了症状果实异味的机理。

柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，CaLas）是诱导黄龙病的主要病原体，其可以存在于叶片、树皮、根、花和果实中。黄龙病不仅减少了柑橘类水果的数量，而且影响了水果的质量。

在黄龙病的影响下：

1、果实较小，不对称且偏斜，种子较小；

2、有症状的果实的轴弯曲，果实的中央维管束变成深黄橙色至褐色；

3、果实成熟时，果实的表面也可以呈绿色；

4、成熟水果酸度较高，具有苦味、刺激性、金属味和许多异味。

尽管已有研究报道了通过代谢组学方法了解柑橘黄龙病菌对橙汁风味的影响，但对黄龙病导致水果出现异味机理尚不清楚。

1.CaLas检测和黄龙病影响的水果症状

作者从商业柑橘林中选择健康和受CaLas感染的树木，并用CaLas特异性引物通过qPCR进行确认。健康树的叶子PCR阴性，而症状树的叶子PCR阳性。但是，无论是健康树还是感染树的果肉都无法检测到CaLas。受黄龙病影响的果实与健康果实之间存在明显的表型差异：有症状的果实比健康的果实更小、更绿（图1），且与健康水果相比，CaLas感染树果实的可溶性固形物含量降低，而CaLas感染树果实的可溶性酸含量比健康水果有所增加。

2. 初级和次级代谢中下调的蛋白质

总共有123种差异蛋白参与了糖分解和糖酵解，加尔文循环，三羧酸循环，氨基酸合成和分解，UDP糖，萜烯和苯丙烷代谢途径的生物学过程（图2）。糖和有机酸代谢涉及45种下调的蛋白质（图3），氨基酸代谢涉及22种下调的蛋白质，萜类代谢涉及5种差异蛋白，3种下调蛋白参与果胶代谢（图4）。

图2 | 有症状和健康水果之间的差异蛋白示意图

3.下调蛋白参与糖和有机酸代谢及体内稳态

与健康成熟果实中的蛋白质相比，蔗糖降解和糖酵解途径中的大多数蛋白质均下调。蔗糖被蔗糖合酶（SUS）降解，生成果糖和UDP葡萄糖。CaLas感染树的果实中SUS表达降低，果糖激酶蛋白丰度在有症状的水果中发生了下调。UDP-葡萄糖可以通过参与糖酵解过程的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-糖焦磷酸化酶催化转化为葡萄糖1P（图3）。它也可以被UDP-葡萄糖脱氢酶催化转化为UDP-葡萄糖醛酸（图4）。在患病水果中这三种酶的水平均低于健康对照组。相反，CaLas下调了许多与丙酮酸代谢相关的蛋白质。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和羧激酶的水平下降。丙酮酸脱氢酶复合物将糖酵解与TCA循环联系起来，其复合体中的相关蛋白在有症状的水果中被下调。

图3 | 与健康水果相比，黄龙病症状水果的糖和有机酸代谢中的蛋白质下调。绿色方块表示下调的酶。

4.糖，有机酸和氨基酸代谢的变化

代谢组学发现与健康对照组相比，有症状甜橙果实中的蔗糖、果糖和葡萄糖浓度分别降低了26％，15％和20％，主要的有机酸柠檬酸和苹果酸分别减少了6.50％和9.20％。而低含量有机酸包括富马酸、奎尼酸和琥珀酸分别增加了48.06％，20.03％和54.82％。有症状的水果中两种酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸的含量降低，而以下中性氨基酸含量增加：丙氨酸（10.00％），天冬酰胺（128.12％），甘氨酸（31.58％），亮氨酸（73.66％），苯丙氨酸（79.44％），脯氨酸（20.57％），丝氨酸（74.14％），苏氨酸（217.79％），色氨酸（61.83％）和缬氨酸（20.39％）。

图4 | 与健康水果相比，黄龙病症状水果的果胶代谢中的蛋白质下调。绿色方块表示下调的酶。

5.萜类化合物代谢中涉及的萜类化合物和蛋白质水平降低

根据质谱峰鉴定和标准品确认，在果肉中共发现6种单萜和1种倍半萜，其含量在黄龙病症状水果中均降低。相关的酶也在症状水果中下调（图5）。

图5 | 单萜和倍半萜代谢中的差异蛋白。绿色下调，红色上调。

糖酵解是植物中重要的代谢途径，它可以提供能量、产生丙酮酸，从而为TCA循环提供动力，还可以提供氨基酸，脂肪酸和次级代谢产物生物合成的前体。

从柑桔果实的膨大阶段到果实成熟阶段，大多数糖酵解酶都被上调。先前的报道显示，糖酵解酶被下调的植物显示出明显的生长迟缓[参考文献1]。本研究结果显示，与健康水果相比，黄龙病症状水果中17种参与糖酵解的蛋白质被下调，这可能是黄龙病中产生较小和未成熟果实的原因。

挥发性化合物在果皮，树叶和其他柑橘类植物部位的油腺中产生，Valencene是一种倍半萜烯，是橙汁中柠檬烯之后的第二大丰富的萜烯，多年来已被用作质量和成熟度标记[参考文献2]。本文实验结果发现黄龙病症状水果中Valencene的丰度降低，这表明其没有以正常的方式成熟。

甘油醛-3-P和丙酮酸是糖酵解过程中的中间产物，为水果中萜类化合物的生物合成提供了碳骨架。本文研究中，黄龙病症状水果中的六种催化从葡萄糖和果糖到甘油醛-3-P的蛋白质含量低于健康水果。且与丙酮酸代谢相关的蛋白质水平在黄龙病症状水果中也发生了下调。黄龙病症状水果中这些蛋白的含量与未成熟的水果相似。

对受柑橘黄龙病菌感染树木的柑橘类果肉进行的研究结果显示，糖、有机酸代谢、体内稳态和萜类化合物代谢受到显着抑制和代谢功能障碍。这些抑制和失调会破坏蛋白质、糖、有机酸和挥发物的生产，导致有症状果肉中糖和萜类化合物的含量降低，从而引起从这种水果生产的果汁中的许多负面特性。

感染柑橘黄龙病菌的橙树果实通常看起来并不完全成熟，并表现出苦味、刺激性和金属感等异味，且导致黄龙病症状水果出现异味的机理尚不清楚。本文作者结合蛋白质组学和代谢组学，对糖、有机酸、体内稳态和萜类化合物代谢等代谢通路进行了详细分析，这些酶和代谢物含量的下调与症状果实未成熟的表型相互印证。作者对代谢组学的分类检测和通过蛋白质组学对代谢通路酶的检测有助于更全面的了解代谢通路的变化，其实验思路值得借鉴和参考。

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部分参考文献：

[1] Rosa-Téllez, S. et al. Phosphoglycerate kinases are co-regulated to adjust metabolism and to optimize growth. Plant Physiol. 176, 1182–1198 (2018).

[2] Elston, A., Lin, J. & Rouseff, R. Determination of the role of valencene in orange oil as a direct contributor to aroma quality. Flavour Fragr. J. 20, 381–386 (2010).

[3] Yao L , Yu Q , Huang M , et al. Proteomic and metabolomic analyses provide insight into the off-flavour of fruits from citrus trees infected with ''Candidatus Liberibacter asiaticus''[J]. HORTICULTURE RESEARCH, 2019, 6(1).

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