代谢组学样本收集知多少~超全攻略让你轻松get！！！

千里之行，始于足下！样本的正确收集以及预处理是实验成功的重要起点，鹿明生物具有多年代谢组学分析经验，给您带来生物样本收集以及预处理经验的干货分享。

代表性和一致性

实验组与对照组样本在取材部位、时间处理等方面尽可能保持一致，从而保证实验的可信度；

迅速性

操作过程迅速，最大限度缩短样本采集到实验的时间；

低温原则

所有样本离体后，分离步骤应在4℃或冰上进行，分离好的样本立即存于-80℃，以免样本产生进一步代谢活动；

血清：

1）用促凝管（没有促凝管则用离心管）收集血液，将促凝管/离心管直立、静置于试管架上，避免振荡、摔落；

2）避免阳光直射，室温；

3）检查凝血完全后，2500 ~ 3000  rpm，4℃ 低速离心5 min，吸取200 µL上清液至1.5 mL离心管中，若上清液较多可每管200 µL、多管分装，于-80 ℃冻存待用；

4）严禁反复冻融，如发生溶血则该样本不合格、需重新准备样本。合格样本用干冰运输。

血浆：

1）用抗凝管采血，采血后立刻轻柔上下颠倒8次，使抗凝剂与血液均匀混合（动作轻柔，以避免产生溶血）；

2）2500 ~ 3000 rpm，4 ℃低速离心5 min，吸取200 µL上清液分装至1.5mL离心管中，-80 ℃冻存待用；

3）血液样本采集后应立即把血浆从全血中分离出来，最晚不迟于采血后1 h内分离出血浆。合格样本用干冰运输。

温馨提示：

（1）试管的使用

涉及到RNA等的多组学实验取样，请勿使用肝素钠抗凝管（对 RNA 相关实验有严重影响，抑制反转录酶活性而导致cDNA量不足）；

核磁实验（NMR）请勿使用EDTA抗凝管（影响图谱采谱）；

代谢实验取样不建议使用柠檬酸钠抗凝管（柠檬酸是TCA循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染），请根据实验具体情况选用合适的抗凝管。

（2）影响因素

取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样；

取血时如有使用麻醉剂，建议用异氟醚消毒，以避免在谱图中出现干扰峰。

（3）产率

血清参考产率：30% ~ 50%（例如：1 mL 全血大约能得 0.3 ~ 0.5 mL 血清）。

血浆参考产率：≈ 50 %（例如：1 mL全血大约能得 0.5 mL 血浆）。

采全血时如使用真空采血管，建议使用促凝管。

（4）冻存管的使用

强烈推荐收集尽量多的样本并分装冻存（同批次样本可以用于多项实验，且避免反复冻融而导致结果不理想），分装保存时推荐使用1.5 mL离心管，因为螺口冻存管帽内有一个密封用的橡胶垫圈，长期在-80 ℃/干冰等低温下，橡胶圈会变硬脆、易脱落，导致管口密封不严，样本渗露。

人粪便：

1）将粪便直接排泄到干净的容器中，尽量避免尿液、马桶壁等对粪便样本的污染，取同时间段样本或将所有样本混匀后再取样；

2）用无菌勺对粪便样本进行挖取，将适量粪便样本放入无菌保存管中，分装样本200 mg/管，迅速放入液氮中15min以上进行淬灭处理；

3）采集好的样本立刻放入-80 ℃保存待用。

小鼠/大鼠粪便：

1）将待取的小鼠/大鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里，排便后立即用无菌镊子转入冻存管；

2）小鼠粪便6-8粒，大鼠粪便2-3粒；

3）若样本需要重复检测，可用无菌棒混匀后多管分装，以避免反复冻融，样本采集后立刻放入-80℃保存待用。

温馨提示：

1.粪便样本尽量不要接触到尿液，避免多样本交叉污染，且尿液中含有大量尿素，干扰后续粪便样本检测。

2.粪便样本收集之后，建议先放入液氮中淬灭15 min后，再放入-80 ℃冻存。

3.建议统一粪便样本形态（如固态、液态（粪水）、冻干粪便等）

4.人粪便样本提供者在取样的近三个月内不可接受抗生素治疗。

尿液：

1）取空腹晨尿、中段尿（临床）或晨间1 h尿（动物）于50 mL离心管中；

2）4 ℃ 下10000 rpm离心10 min取上清，用1.5 mL离心管分装，保存于-80 ℃。

3）动物1 h尿量不够的情况下，可分多次收集尿液；如需收取24 h尿液，需要使用带低温装置的代谢笼收集，并且及时冻存样本。

4）收集完尿液样本后，建议使用液氮淬灭15 min后，再分装多管后于-80 ℃冻存。

动物组织（包括脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤等；软体动物如血吸虫）：

1）取适量组织器官，用预冷的PBS缓冲液或生理盐水清洗干净；

2）迅速剥去非必需的脂肪和结缔组织，再用PBS缓冲液或生理盐水冲洗干净；

3）用干净的无尘吸水纸吸干水分，将组织分成50-100 mg / 管分装待用；

4）管子上做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min，-80 ℃冻存；干冰运输。

植物组织：

叶片、茎、花：

1）取整片叶片/一段茎/一朵花，放入离心管或锡箔纸中并标记，迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

2）将装有样本的离心管迅速放入自封袋中（每组一袋），在自封袋中放入标签纸注明样本信息。

3）迅速放入-80 ℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

注意：（1）采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。（2）采集样本时保持样本一致性，尤其是同一组样本（颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等）。

根：

1）取整株植物的根部，迅速用PBS缓冲液或者超纯水漂洗掉根上的泥土、培养基或营养液等；

2）吸水纸吸干水分后，分装为500 mg/管；

3）标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min，-80 ℃冻存，干冰寄送。

果实、种子：

1）对于含水量高、体积较大的果实（番茄、西瓜、苹果等）需要先将样品分成“均匀”的小块(≈ 200 mg/样本)分装至2 mL离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

2）对于细小的颗粒种子(拟南芥种子、谷物种子等)，可以先将同一组的植株种子混匀后再分装(≈ 200 mg/样本)至离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

3）对于要求对整个果实进行提取的（整粒葡萄等），需要把果实装在50 mL离心管/自封袋中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min，-80 ℃冻存，干冰寄送。

温馨提示：

1.对于动物组织样本无法满足50mg/样，如海马组织，大脑组织等，可考虑同组混样以达到50mg/样的要求。

2.对于含水量高的果实进行取样很难保持高度均一性（如番茄的果皮、果肉等），建议将整个果实进行液氮研磨后冻干混匀，对混匀后的粉末进行称重分装，冻存。

3.尽量不要使用锡箔纸以及自封袋包装样本，建议将样本液氮研磨后使用离心管/冻存管进行分装。

4.在使用PBS缓冲液/超纯水进行漂洗时，需要尽快处理。

5.植物各类组织样本建议都使用超纯水进行漂洗完之后，再研磨分装冻存，防止因种植过程中施加的一些肥料、农药等含有表面活性剂或其他杂质，对后续实验造成影响。

悬浮细胞

1）连同培养基转移到1.5 mL的进口离心管中。

2）低速离心5 min（低于3000 rpm），使细胞沉淀于离心管的底部（1*10⁷个细胞为宜）。

3）倒掉培养基（尽量倒干净），用预冷的PBS反复冲洗2 ~ 3次，低速离心5 min，弃上清。

4）标记离心管，将离心管的尖端插入液氮中，淬灭细胞沉淀1 min，-80 ℃冻存，干冰寄送。

贴壁细胞：

1）小心弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上尽量吸干培养液；

2）加入4 ℃预冷的PBS平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞（若用移液枪加，则靠着培养皿壁加入，以免将细胞冲起），然后弃PBS（建议用微量移液器少量多次吸尽残余PBS）；

3）将培养皿底部（外壁）接触液氮，淬灭细胞（1*10⁷个细胞为宜），加入500 μL预冷的甲醇-水（4：1，V/V），用干净的细胞刮棒将细胞刮下，用移液枪转移至1.5 mL离心管

4）继续加入500 μL甲醇-水（4:1，V/V），将剩余的细胞尽量全部转移至离心管中，使用封口膜将离心管密封，保存于-80 ℃，干冰寄送。

温馨提示：

1. 培养基倾倒时尽量倒干净，可使用滤纸将残留培养液吸净；

2. 甲醇/水请使用色谱纯及以上规格；

3. 液氮淬灭细胞时，请小心避免离心管破碎导致样本受损;

4. 建议细胞样本在进行培养时多准备样本，以备后续使用;

5. 贴壁细胞收集时如遇培养皿较大，1 mL试剂无法完全转移完全时，建议加入最大试剂体积不超过 3mL;

6. 若无试剂条件，也可在淬灭细胞后，不加入甲醇-水试剂，直接用干净的细胞刮棒将细胞刮下，转移至离心管;

微生物样本

适用样本：大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒酵母菌、恶臭假单胞菌、酵母、棒杆菌属、单胞藻、运动发酵单胞菌、氧化葡萄糖酸杆菌等。

1）连同培养基转移到进口的15 ml的离心管中，3000 rpm以下低速离心，使细菌沉淀于离心管的底部（1*10⁸个细菌为宜）；

2）倒掉培养基（尽量倒干净）后，用预冷的PBS溶液小心重悬清洗沉淀一次，4 ℃ 1000 g离心10 min收集菌体，弃上清；

4）将离心管的尖端插入液氮中，淬灭细菌1 min，然后-80 ℃冻存，干冰邮寄，每个样品最好准备两管以备用。

温馨提示：

（1）请先拿空离心管的尖端插入液氮中试试离心管的质量，避免因离心管破裂造成样本损失。

（2）操作尽量迅速，培养基尽量倒干净，可用滤纸条将管底部残留的培养基吸尽。

（3）微生物代谢速度非常快，所有的步骤需尽快完成。

（4）菌体数量不同的样本间需要保持一致。

（5）菌液的OD值仅供参考，需要根据具体情况确认菌浓度。

微生物培养液（检测胞外代谢）:

方法一：

培养好的菌液混匀后，取10 mL菌液，用0.2 μm孔径的过滤膜进行快速抽滤，去除菌体。将滤液按1 mL/管进行分装，‐80 ℃冻存，干冰寄送。

方法二：

培养好的菌液混匀后，取1 mL菌液，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清800 μL，‐80 ℃冻存，干冰寄送。

微生物—胞外代谢物（细胞上清）

1）使用合适的容器收集细胞培养液或其他生物液体；

2）3000g，4℃，离心15min，小心转移上清液至新的无菌离心管中；

3）将分离出的细胞上清液16000g，4℃，离心10min（枪头不要触碰到管底一侧的杂质）小心转移上清到新的无菌离心管中，-80℃保存。足量干冰寄送。

温馨提示：

因培养基中可能含有高糖、高盐、高渗等成分，可能影响后续质谱上机检测，因此建议先进行售前咨询。

体液样本（如关节液、唾液、胆汁、脑脊液、瘤胃液等）

1）收集体液样本；

2）3000 rpm， 4 ℃ 离心15 min，取上清，0.5 mL/管分装至1.5 mL离心管中；      

3）-80 ℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

根际土壤样本

1）去除（抖落）根周松散的土：应尽量保证完整的根组织，并去除多余的土。

2）缓冲液震荡洗下根际土（紧密粘附）：为防止在震荡过程中对微生物和根组织细胞的破坏，此处建议直接使用无菌水处理，震荡时有手动的，也有用摇床等震荡的，时间和强度根据洗涤的难易程度和根组织而异。

3）高速离心收集沉淀：用无菌水冲处理后之后，可高速离心后收集土壤沉淀，若沉淀较少，也可用提取水体DNA的方法，经0.22μm滤膜过滤收集土壤和微生物或者或者直接真空冻干处理（无冻干条件，可直接浊液冻存寄送，由实验室进行冻干，再取样做实验）。

4）保存：干冰寄送，低温-80℃保存。

根系分泌物样本

1）取整株植物的根部，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土；

2）将整株根部至于装有超纯水的大容器中，培养一段时间；

3）取一定体积的根系分泌物液体样本, 1200rpm离心15min，去除杂质，用冷冻干燥仪冻成干粉；

4）-80度保存；足量干冰寄送。

温馨提示

1. PBS快速冲洗;

2. 根系分泌物所需体积因为培养植物根部分泌物质量不同，所以需要根据最终浓缩成干粉的量来定；

3. 因为粉末在寄送过程中容易分散到管壁，不好称重。建议在冻干前将EP管称重，冻干后将EP管和冻干粉一起称重后，记录清楚。

代谢组生物学重复建议

微生物和植物：建议每组生物学重复 ≥ 6 - 8个；

模式动物：建议每组生物学重复 ≥ 8 - 10个；

临床样本：建议每组生物学重复 ≥ 30个；

备注：

1. 在允许的条件下，多准备一份样本备用，且注意分装保存，避免反复冻融；

2. 样本数在10个以内的项目实验室默认不做QC，如有必要需备注；

3. 样本需干冰运输：快递途中干冰消耗率约为5KG/ 天，消耗速度与气温，泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系，请酌情添加干冰

样本量需求：

以上为常见样本的收集方法以及样本量需求，如果您的样本类型不包含在此说明内，欢迎给小鹿留言，我们有非常丰富的代谢样本收集和预处理的经验，可以与您分享；如果您收集的样本量没有达到以上要求，欢迎咨询我们的客户经理/技术支持，进行预实验测试，我们会以最低的样本量需求进行最严谨、可靠的实验！

请持续关注我们，后期会继续分享代谢组实验设计、数据质控、代谢物定性筛选等代谢组学说明姊妹篇，不要错过哦！

长按扫码添加“小鹿”咨询更多样本准备详情

END

栗子  撰文

欢迎转发到朋友圈

本文系鹿明生物原创

转载请注明本文转自鹿明生物