2021-01-07 11:56:53, 4D-组学老虎队 布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器
离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。
4D-Proteomics
™是在3D分离即保留时间(retention time)、质荷比(m/z)、离子强度(intensity)这三个维度的基础之上增加了第四个维度,离子淌度(mobility)的分离(图1),进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度,带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。图1. 新一代4D-蛋白质组学示意图
骨骼肌(musculoskeletal)蛋白质组学研究挑战
骨骼肌中含有丰富的肌球蛋白(Myosin),肌动蛋白(Actin),肌联蛋白(Titin),占总蛋白的25%。这些蛋白质相互作用完成了肌肉的收缩与舒张。在人类基因组中有超过40个肌球蛋白基因编码12类不同的蛋白质。肌联蛋白是已知的最大的蛋白质,有超过35000个氨基酸,分子质量高达3mDa,经胰蛋白酶消化可产生超过3000多条肽段。
图2. 肌节的二维图示:显示肌球蛋白、肌动蛋白和肌联蛋白
自下而上(Bottom-up)的蛋白质组学分析方法受限于骨骼肌样品中的高丰度蛋白,如肌球蛋白和肌联蛋白,它们产生数以万计的冗余肽段信息。在基于数据依赖采集(DDA)的模式中,大量的质谱时间都花在少量却丰度高的多肽上,而不是增加蛋白质组覆盖的深度。为了得到更深的骨骼肌蛋白组覆盖深度,通常采用二维液相分级,分为不同馏分来增加蛋白鉴定量。
图3是采用传统蛋白组学平台分析肌肉组织样本,经过TMT标记后,再预分级为12个样本,总共可以鉴定到2190种蛋白质(图3A),19986个肽段信息。但在谱图与肽段的匹配中(PSMs)可以发现,55%的肽段信息属于前15种高丰度蛋白(图3B),其中包括肌动蛋白、肌球蛋白、肌联蛋白等,前15个高丰度蛋白鉴定结果见表1。
图3. 采用传统蛋白组学平台分析肌肉组织样本结果
表1. 肌肉组织中TOP15高丰度蛋白鉴定信息
实验设计与结果
样本
肌肉组织样本:提取蛋白并酶解后,肽段经过高pH进行预分级,得到9个组份。
分析条件
传统蛋白质组学质谱平台采用180min梯度的色谱方法;
4D-蛋白质组学平台采用90min梯度的色谱方法。
结果
相对于传统蛋白质组学技术,基于timsTOF Pro的4D-蛋白质组学平台因为更多快的采集速度和更高的灵敏度,可以采用更短的色谱梯度而鉴定到更多的蛋白质。
图4A显示,timsTOF Pro采用90min的方法,可鉴定到3478种蛋白质,比传统蛋白质组学平台(2222种蛋白质)要高出56%,而使用的时间却减少了一半。
图4B和图4C也显示出timsTOF Pro超过120Hz的采集速度在肽段和PSMs上的鉴定优势也非常明显(特征肽段鉴定数量增加了三分之一,肽谱匹配数(PSMs)增加了一倍)。
图4. 不同蛋白质组学平台分析结果比较。A. 蛋白鉴定数目比较;B. 多肽鉴定数目比较;C. PSMs数目比较
面对高丰度蛋白的影响,样品分馏可以降低样品分析的复杂程度,提高蛋白质和肽段信息的鉴定数量。将预分级技术与布鲁克4D-蛋白质组学技术结合,则可进一步提高样本鉴定深度,通过不同维度组合对骨骼肌样本分离分析,将为寻找人类疾病生物标志物提供新的数据深度。
参考文献:
Emma Doud et al., Deeper proteome coverage of musculoskeletal samples,ASMS 2020
Herzog, Walter. “The multiple roles of titin in muscle contraction and force production.” Biophysical Reviews vol.10,4 (2018): 1187-1199.
Mosley, Amber et al. “A label free quantitative proteomic analysis of the Saccharomyces cerevisiae nucleus.” Journal of Proteomics vol 72,(2009):110-120.
Meier, Florian et al. “Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.” Molecular & Cellular Proteomicsvol. 17,12 (2018): 2534-2545.
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