CESI-MS对不同单克隆抗体的酶解产物进行生物类似药评估

毛细管电喷雾（CESI）是将毛细管电泳（CE）和电喷雾离子化（ESI）整合在一根毛细管中的装置（如图1所示）。CESI-MS在低至纳升/分钟的流速下运作，拥有许多技术优势，包括离子化效率高和离子抑制效应低等。CESI-MS依靠待分析物的电荷和大小来进行分离，因此可以作为一些传统分离技术，如反相液相色谱的补充分离手段。CESI-MS已被用于单克隆抗体的分析。

本文我们将介绍利用CESI-MS对市场上的单克隆抗体药物和其他候选的生物类似药进行分析和比较。一次CESI-MS的进样分析可以同时检测蛋白的翻译后修饰和序列覆盖度。这些数据可用于比较单克隆抗体药或生物类似药。

本工作分离采用SCIEX的CESI 8000 Plus高性能毛细管电泳及电喷雾质谱接口系统，质谱使用的是SCIEX TripleTOF® 5600系统，并配有NanoSpray®Ⅲ质谱源。

氨基酸序列是表征生物类似药的一个关键指标。因此，本工作比较了两类标准单克隆抗体药物赫赛汀(trastuzumab)和西妥昔单抗(cetuximab)和两类生物类似药候选药（Trastuzumab-B和Cetuximab-B）的序列。对于Trastuzumab和Trastuzumab-B，其酶解产物的单次分析表明，两者在重链（HC）和轻链（LC）上均有100 %的序列一致性。（图2）

图2. 由CESI-MS/MS获得的Trastuzumab（左）和Trastuzumab-B（右）序列覆盖情况。

当比较这些序列时，研究者们发现，生物类似药和原始的单抗药物间仅在重链的217位置处有一级序列的差别。通过分析MS/ MS的谱图，可以确认，Trastuzumab-B在217位置处的赖氨酸残基被一个精氨酸取代。（图3）

图3. Trastuzumab（1）和Trastuzumab-B（2）的MS/MS质谱图。此图显示Trastuzumab-B中m/z为517.3095（1+）碎片的消失和314.6937（2+）碎片的出现表明了有一个赖氨酸变成了精氨酸。

对Cetuximab和Cetuximab-B也进行了相同的实验，原始的单抗药原研药和生物类似药在氨基酸序列上也有100 %的一致性，同时这些序列也完全一致。为了确认此结果，每次实验都重复了3次，并得到了相同的结果。此外，有多于70 %的y/b多肽碎片离子在二级质谱图上被观测到。在Trastuzumab的实验中，这一数值达到了90%以上。如此高的二级质谱碎片覆盖度只可能在CESI-MS/ MS超高的离子化效率（在低于40 nL/min的流速下）和质谱系统快速的扫描相结合的条件下才可达到。这样的组合十分适合于分析蛋白的翻译后修饰情况，并用于区分单抗药物和它的生物类似药。

糖基化是单克隆抗体的重要修饰，它影响着蛋白的稳定性。在本工作中并未将样品上的糖基化修饰酶解掉，因此可以通过鉴定糖肽来直接分析样品的糖基化情况，这使得鉴定糖基化的位点也成为可能。在分析Trastuzumab和Trastuzumab-B时，鉴定出了16种不同的糖型。当对原研单抗药物和生物类似药进行半定量分析比较时（图4），两个生物类似药均表现出与原始单抗药不同的糖型分布。

图4. 利用CESI-MS/MS分析得到的Trastuzumab/Trastuzumab-B和Cetuximab/ Cetuximab-B Fc端多肽的不同糖型情况。

除了糖基化，其他关键质量属性（CQAs）在生物类似药的分析中也十分关键。这些关键质量属性包括一些可能对免疫原性有影响的翻译后修饰位点、蛋白的药代动力学和药效学(PK/PD)值以及由N端的谷氨酰胺/谷氨酸环化形成的各个位点的N端焦谷氨酸（pE）、天门冬酰胺去酰胺化（deaN）、甲硫氨酸氧化（oxiM）和天冬氨酸异构化（isoD）。CESI-MS/MS的数据可以用于分析不同单抗药物的这些翻译后修饰位点。

在CQA的分析中，翻译后修饰引起的结构变化往往引起多肽电荷改变并影响了它的电泳淌度（如deaN在0.5 min的峰和pE在几分钟处的峰）。这些都帮助了CESI-MS/MS的分离和鉴定。利用CE作为分离多肽的技术有着极大的吸引力。图5便展示了利用电泳可以分离质荷比一致的仅在天冬氨酸处有变化的多肽，这是单用质谱无法得到的结果。当然，高质量的二级质谱图对多肽及其修饰的鉴定起着极大的辅助作用。

图5. HT22多肽（序列为278-291）质荷比为839.408（2+）的提取离子流图（EIE），两个峰表示着天冬氨酸的不同异构化。

值得一提的是，在本工作中，每个单克隆抗体的序列覆盖度、翻译后修饰位点的检测和糖基化位点的分析均可在一次进样的实验中完成。

利用CESI-MS/MS分析单抗药物及其生物类似药，可以在单次进样中分析单克隆抗体样品的多种蛋白质结构性质。这些性质包括：

• 100 %的氨基酸序列覆盖度；

• 糖基化位点的鉴定和分析；

• 翻译后修饰位点的鉴定和分析。