轻松分离大片段 DNA，只要这一步？

凝胶电泳是每个实验员都逃避不了的低技术含量日常工作。分离几 Kb 的片段那是信手拈来，可万一不巧要分离十几 Kb 的大片段 DNA，那只能穷尽毕生所学，拿出十八般武艺来。

分离大片段 DNA，怎么办？各路英雄，在线等！

各门各派招式不尽相同，有通过降低琼脂糖浓度至吹弹可破的境界的，有变换兵器改用低熔点琼脂糖的，有降低电压慢工出细活的，而由于长时间拉锯战会导致溶液温度升高，也不乏个中高手把电泳槽置于冰块上或冰箱里的。对于经常需要操作大片段 DNA 的实验室，那必然是要配备脉冲场电泳，此乃解决长片段及超长片段核酸分离的武功心诀。

何为脉冲场电泳？请指教！

要回答这个问题，我们先来看看 DNA 在常规电泳过程中的行为变化。我们知道凝胶电泳是利用分子筛的原理分离不同大小的核酸片段的。凝胶浓度越高，孔径越小；浓度越低，孔径越大。根据目标片段的大小，我们会通过调整凝胶的浓度让核酸们能够顺利的通过并实现清晰的分离。

但当核酸分子大到一定程度，比如长度超过 20 Kb 时，它的高级结构已经超过了凝胶的孔径。此时在电场作用下大分子 DNA 为了能够通过比它还小的凝胶孔洞，会改变无规卷曲的构象，沿着电场方向将自己伸直，与电场平行地通过凝胶。

这就好比 50 个小学生抱成一团要进教室肯定不行，规规矩矩排成队就能通过教室门了。但这样的话，凝胶就起不到分子筛的作用了，因为大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别，也就不能实现对不同大小片段核酸的分离了。所以，面对大片段，光靠凝胶的分子筛和直男一般的直流电场是行不通的。

脉冲场电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE）顾名思义，电场不是恒定的，而是在两个不同方向的电场间进行周期性交替。DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应调整构象所需的时间显著地依赖于分子大小，这就好比 10 个人的对伍调整队形要比 50 个人的队伍调整队形容易的多。

DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，在电场切换后重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的 DNA 调整得快，因而移动得较快。基于上面的原理，脉冲场电泳得以对不同大小的大片段进行分离。

较常见的基于琼脂糖的脉冲场电泳，其变换的电场呈现一定的夹角，称为脉冲变角凝胶电泳。由于 DNA 片段仍然在琼脂糖的泳道里泳动，而电场又呈夹角变换方向（图 1）。

咦，样品会不会跑到隔壁泳道？

当然有可能，而且实际操作中还会遇到多种多样的问题。为了保证琼脂糖脉冲场电泳实验顺利进行，实验时要特别注意优化电场转换的时间、凝胶的浓度、电压的强度、缓冲液的温度、电泳槽是否水平，上样量的多少等诸多因素。

图 1. 常见的基于琼脂糖的脉冲场电泳电场方向变换示意图

优化完实验条件后，就需要实验员们的耐心等待了。如果你今天做上了琼脂糖脉冲场电泳，还约了女朋友晚上去看电影，建议你俩还是在实验室里一边看免费电影一边看电泳吧。

此话有误！为何隔壁老王下午才做上脉冲场电泳，这会儿已收拾妥当，牵起女友小手吃饭看电影去了？！

没啥不对，因为隔壁实验室早就换成了安捷伦的全自动平行毛细管脉冲场电泳了——Agilent Femto Pulse 全自动脉冲场电泳系统:

• 可在约 1.5 小时内分离长达 165,000 bp 的 DNA 弥散条带和片段，比琼脂糖脉冲场凝胶电泳快 10 倍；
• 超高灵敏度试剂盒可测定起始浓度低至 50 fg/μL 的 DNA 片段；

• 可同时分析 12 个样本，仪器内最多可同时容纳 3 块 96 孔板，实现无人值守的连续分析。

图 2. Agilent Femto Pulse 系统及软件界面

为何偏偏要选安捷伦？还望英雄知无不言！

Agilent Femto Pulse 系统采用了倒转电场凝胶电泳（Field Inversion Pulsed Field Electrophoresis ，FIGE）。倒转电场凝胶电泳是脉冲场电泳的一种。顾名思义，倒转电场凝胶电泳的电场不是呈夹角而是呈 180°，即正好方向相反。

电场的作用方式若仍然以列队前进来比喻的话，就好比每往前走几步后再倒退几步（前进的步数多于倒退的步数）。大部队变换队形调整方向比小部队慢，所以在这前进/后退的切换中，小分子走得快，大分子走得慢，从而实现对片段的分离。

由于 Agilent Femto Pulse 采用的是毛细管电泳，每根毛细管就是一个独立的泳道，样本间互不干扰；由于采用的毛细管，只需极微量的样本即可实现检测，并且电泳的速度相比普通的凝胶脉冲场电泳快了 10 倍。

图 3. Agilent Femto Pulse 系统与常规凝胶脉冲场电泳实验时间的比较

Agilent Femto Pulse 系统可以：

• 在 1.5 小时内分离高达 165 kb 的高分子量基因组 DNA；
• 准确测定 BAC 酶解产物的分子量；
• 为三代测序长读长、低浓度文库进行可靠质控，并同时测定分子量、浓度，与检测污染物；
• 出色分离 7 个或更多游离 DNA 核小体片段和基因组 DNA 污染；

• 对低浓度总 RNA 与 mRNA 进行可靠的定量与定性分析。

“科技就是生产力，就是实验员的幸福生活。我也要用 Femto Pulse 系统攻克超长片段 DNA 样本，告别繁琐而漫长的凝胶电泳，从此像隔壁老王师兄那样工作生活双丰收！”

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