探秘：测序的贵，到底值不值？

2020-05-22 03:36:19, 安捷伦科技安捷伦科技（中国）有限公司

近几年随着二代测序成本的降低，大家已习惯了将样本直接外送。老司机通常关注的是哪家的捕获 Panel、捕获区域大小是多少，但你是否关注过测序公司用的是哪种捕获建库 pooling 方法呢？

捕获 Panel 关系着目标区域是否被覆盖到，只有 Panel 的设计包括了目标区域，后续才可能被抓取下来进行测序分析，因而是必需关注的重中之重；而捕获建库 pooling 方法往往被大家所忽略，这直接关乎数据的成败，但外包之后几乎没人关注。

今天我们就来讲讲里面的门道，千万别为了低廉价格，牺牲了结果的可靠性，导致项目重做而耽误研究进度！

一些基本概念

捕获建库：就是二代测序的目标区域，即对目标序列进行富集捕获的文库构建方法。一般流程如下：

DNA 片段化
末端修饰
接头连接
Pre-PCR 扩增
探针杂交，洗脱
Post-PCR 扩增

经过严格的质量控制，才能生成符合测序要求的文库，进行目标序列的高通量测序。

Pooling：即混合样本。由于现在测序仪的通量都特别高，不可能一次只测一个样本，因此会对样本进行 pooling，最大化利用测序仪的通量。

Sample index：是二代测序文库构建中最常用的样本标记方法，用于区分不同样本的测序数据。Sample index 通常是一段 6-8 个碱基组成的 DNA 序列。在文库构建过程中，每个样本的文库都要分别带上不同序列的 sample index，像样本的“身份证号”一样，能把 flow cell 里所测得的海量序列正确地拆分。

常见的捕获建库 pooling 方法：单杂与多杂

Post-capture pooling：常被称为单杂，主要特点是一个样本对应一份探针，样本管中探针与样本组成杂交体系，然后，不同序列的 sample index 加到每个样本的文库上（protocol 以安捷伦试剂盒为例）。文库构建完成后，QC 合格的样本根据样本测序数据量的需求进行混样，形成用于上机测序的样本。

Pre-capture pooling：常被称为多杂，主要特点是多个样本同一份探针。不同的 sample index 在杂交捕获前分别加到每个样本上，QC 合格的样本进行等量混样，形成多个样本组成的混合 pool，每个 pool 再共用一份探针进行杂交等流程。最终形成多样本混杂的杂交体系。

图 1. post-capture pooling 与 pre-capture pooling 示意图

两种捕获建库 pooling 方法的比拼

Post-capture pooling

优点：

1）上机测序前样本互相独立操作，每个样本的终文库均经准确定性、定量。每个文库独立质控，不合格的样本可以随时重做，合格后再与其它样本进行上机前的混合。

2）样本数据量均一性更好。Post-capture pooling 的样本在测序前经过了准确定性、定量，使得单个样本的测序量可预期、可调整。

3）文库复杂度更高。每个样本对应一份探针，保证足够量的、经过严格质控的预文库进入杂交体系，与足够量的探针进行杂交。文库的复杂度被尽可能高地保留下来，大大提高低频突变检出的可能性。

4）对于要求不同数据量的样本，采用 post-capture pooling 方法建库的样本可以灵活地在上机前调整样本的浓度以实现不同的测序量。

缺点：

1）成本相对较高

2）相比 pre-capture pooling 通量较低

Pre-capture pooling

优点：

1）单个样本捕获建库成本相对较低

2）捕获后的样本管数量明显下降，提高了建库操作的通量

缺点：

1）测序数据量不均一

Pre-capture pooling 是在样本与探针杂交前先将样本进行均一化处理，然后混合在一起。由于不同样本的完整性或来源不同，与探针的杂交效率会有差异，导致最终的混合文库中每个样本子库量的不均一性，在结果中表现为：不同样本的测序数据量不均一，即部分样本测序量不足，而另一部分样本测序量大大超过预期。

为了确保每个样本都达到预期最低测序量，就要对整个 pool 的文库增加测序量。加测的数据量与整体 pooling 样本的数据均一程度直接相关，并且取决于数据量最少的那个样本以及它占整个 pool 数据量的比例，反而增加了测序成本。

如果你还保留了 pre-capture pooling 前的样本，也可以针对测序量不达预期的那几个样本重新单独建库捕获和测序，测序成本增加；而 post-capture pooling 相对灵活，如果有某个样本数据量不足，只需将单个样本的文库挑出来补测对应的数据量即可。

图 2. Post-capture pooling 和 pre-capture pooling 对测序数据均一性影响的差异。前者的均一性显著优于后者

2）文库复杂度降低

Pre-capture pooling 是多个样本混合形成一个 pool 进行杂交，通常需要减少单个样本杂交前文库的投入量（即初始样本量减少），以保证整个 pool 的文库总量匹配探针的量及杂交体系；否则，杂交体系中的探针相对含量将减少（即捕获探针量不充足）。两种情况均可能导致较高的靶标丢失，降低文库的复杂度。

文库复杂度低，会导致更高的 duplication，降低检测低频突变的性能，导致丢失低频变异。特别是样本本身完整性不高的情况，文库的复杂度将大打折扣。

3）不适用于预计测序量差异大的样本

除了上面两点，pre-capture pooling 只适用于同一个 pool 里的样本有相同或相近的预计测序量，如果预计测序量差别大，这样的样本就不能 pool 到一起进行杂交。

单杂和多杂，该怎么选？

在不考虑成本及通量的情况下，Post-capture pooling 是一种更稳定、可靠和灵活的建库方法。研究者也可以根据自己的实际项目情况和应用需求，决定是否可以把多个样本 pool 在一起，以平衡 pre-capture pooling 及 post capture pooling 的使用。

以下 3 种情况，建议考虑使用 post-capture pooling：

1）高深度测序检测低频变异。post-capture pooling 的文库复杂度更高，更不容易丢失样本中含有的稀有变异分子。如果采用 pre-capture pooling，其文库的复杂度可能导致低频变异的丢失；而其数据不均一性则反而会导致测序成本的极大增加。

2）样本质量较差，如降解程度较高的 FFPE 样本。这类型的样本在测序数据上的不均一度更高，post-capture pooling 的单个的文库构建有利于最大限度挖掘样本中的数据。

3）样本来源多样或质量不一致。这类型的样本在测序数据上的不均一度更高，post-capture pooling 的单个文库构建能最大限度平衡数据分配。

为了平衡成本与通量的要求，以下 2 种情况酌情考虑采用 pre-capture pooling：

1）高质量、充足的样本量，同时检测的靶标不是较具有挑战性；

2）满足上述情况，同时对数据要求相对不太苛刻。

至于探针杂交前 pool 多少样本才算合适？再次强调：一切脱离实际测序表现以及项目对数据的需求谈 pooling 数目都是耍流氓。能够 pool 多少个样本，取决于实际项目对测序深度的需求、操作者自身 pooling 操作均一性的水准，以及样本质量等诸多因素的综合考量。要在满足项目需求的前提下再考虑成本，否则就有损了科学研究的客观性，偏离了本真目的了。

安捷伦建议：在服务外包时与服务商深入探讨你的研究项目，确定捕获 panel、建库方案、质控标准，测序深度等关键信息。

安捷伦个性化建库方案

SureSelect XT 建库试剂盒：最经典的 post-capture pooling 建库方法，适用于广泛的样本类型，兼容 FFPE 样本。

SureSelect XT HS 安捷伦最新的带有分子标签的建库试剂盒：

加入分子标签标记文库，可提高阳性预测值；
用于 post-capture pooling 时能大幅提高低频变异的检出率，针对 FFPE 样本优化；
用于 pre-capture pooling 时平衡了成本效益与通量，适用于样本量充足、完整性好的样本的部分应用。

SureSelect XT Low Input 低起始量建库试剂盒：

配有 192 个单 sample index 和双 index 供客户灵活选择，满足高通量测序仪对更多样本同时测序的需求；
低至 10 ng 样本起始量；
既可用于 Post-capture polling（结合 XT 捕获探针一起使用），亦可用于样本量充足、样本完好情况下部分应用的 Pre-capture pooling（结合 XT2 捕获探针一起使用）。

SureSelect XT2 捕获探针：

针对 pre-capture pooling 的特点对探针进行了特殊优化，适应于多样本混合杂交体系。（安捷伦早在 2012 年就推出了专门针对 pooling 的探针）。