质粒工艺：质量何立？

2019 年年底新冠病毒肺炎暴发，带来的影响仍然在持续。针对性的疫苗研发已经紧锣密鼓的开展。作为候选之一，质粒 DNA 疫苗免疫原性好、效果持续时间长，制备简单，安全性好，便于储存和运输，在应对这一突发重大传染病中具有独特优势。

质粒 DNA（pDNA）的纯化是其应用的关键步骤。常规制备中，pDNA 需要从蛋白质、RNA、基因组 DNA（gDNA）以及内毒素等中分离。此外，初步纯化的质粒 DNA 构型除超螺旋（scDNA）外，还有开环（ocDNA）等形式，而超螺旋结构的 pDNA 才具有最高的转化和表达效率。

为满足药用质粒临床应用的纯度和可放大性的要求，Cytiva（原GE医疗生命科学事业部）建立了如下的质粒纯化平台（ 质粒纯化工艺的新篇章-通用型质粒纯化工艺平台）

图1 质粒纯化的工艺流程图

质粒工艺的主要目标在于两点：纯化与规模化。

本文结合实践，针对工业规模制备质粒 DNA 的要点及部分难点的解决方案做了总结。

01

碱裂解过程的控制要点

裂解过程中 NaOH 与 SDS 破坏细菌细胞壁/膜，同时强碱会打开双链 DNA 碱基之间的氢键，gDNA 变为线性的单链 DNA（ssDNA），而 pDNA 可以保持完整结构。中和后单链的 gDNA 与 SDS、变性蛋白及细胞碎片通过疏水作用结合在一起，形成絮状沉淀。尺寸更小的 pDNA 分子以双链超螺旋状态存在因而保持溶解性。

因此，碱裂解释放了 pDNA，同时建立了 pDNA 与大量杂质之间通过固液分离实现初步纯化的条件。

碱裂解过程中需要注意如下问题：

NaOH 新鲜配置

长时间保存的 NaOH 与空气中的 CO₂ 反应，导致实际浓度降低，影响裂解效果

控制裂解反应时间

一般控制在 0.5-10 min。裂解时间过长会导致 pDNA 不可逆的损伤，产物的收率和质量降低

温和高效的混合方式

剧烈的混合操作产生的机械剪切会导致 gDNA 断裂为类似 pDNA 大小（～10 kb），进入溶液；反之，混合效率不足会导致局部碱浓度过高，pDNA 形成不同构型，进而成为下游纯化的挑战。

02

菌体裂解液的前处理

碱裂解液中和后立即形成白色絮凝，其主要包括细胞碎片、变性蛋白及 gDNA。小规模的固液分离方式主要采用离心方法。其一难于放大，其二絮凝部分具有近似溶液的密度，使其沉淀需要高的离心力，产生的机械剪切容易导致 gDNA 的断裂和释放。

Hans 等报道了一种快速澄清的方法（Flocculate removal after alkaline lysis in plasmid DNA production, 2011, Vaccine）。向中和后溶液中直接加入固体 NH₄HCO₃（5 g/L），随即产生大量 CO₂ 与 NH₃。气体能够带动固体部分上浮至液体表面，形成相对稳定的絮凝层。因而澄清的溶液可以从容器的下端获得。

基于小试及中试规模，平行对比实验证明添加 NH₄HCO₃ 对 pDNA 的产量和纯度无明显影响。这一方法操作条件温和，同时大大减轻了后续澄清的压力。

图2 940 g 菌体的 30 L 中和产物中加入 NH₄HCO₃ 的结果

03

ocDNA 与 scDNA 分离条件的优化

scDNA 为双链的共价闭环结构，而在发酵及裂解操作中一条链的断裂会导致分子螺旋性的消失产生 ocDNA。ocDNA 与 scDNA 分子性质高度类似，区别在于后者具有更高的碱基暴露程度和表面电荷。

Capto Plasmidselect 利用独特的嗜硫亲和作用，高效区别这两种形式的细微差别，成功用于分离制备。需要注意的是，对于大小和序列不同的质粒，纯化的最佳条件略有区别。推荐利用 DOE 方法对上样条件进行优化：

04

提高收率的途径

收率是贯穿工业制备整个过程的关键要素之一。对于质粒这一具有高度亲水性、高荷电以及超螺旋构象的分子，提高收率的途径有别于经典的蛋白纯化。建议如下：

Step

1

Sepharose 6 FF 作为分子筛层析，快速去除大量 RNA，收率一般>90%。柱效与上样体积及样品粘度需合理匹配，以保证纯度与收率

Step

2

Capto Plasmidselect 高效分辨 scDNA 与 ocDNA，收率可>70%。收率低时考虑延长洗脱液的孵育时间

Step

3

Source 30Q 用于精制阶段，利用高分辨率去除痕量内毒素及 gDNA。如果收率低，可以尝试 Capto Q impres，收率可>80%（如下示例）

图3 Capto Q impres 纯化质粒（~6 kb）的色谱图

总结

随着新的挑战不断出现，质粒的应用成为一种潜在有力的应对手段。而其独特的分子特性及面临的杂质体系，都对工业规模的制备提出了挑战。本文基于大量文献及实践经验，汇总了质粒制备中的难点及要点，以供一线制药同仁参考。

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