连发五篇：看Biacore如何助力新冠病毒入侵机制研究及治疗药物发现

抗病毒药物的研发有多种方案，目前比较常用的主要有以下两种：

一是通过对病毒与相应受体结合的结构解析，发现两者互作的界面，并针对这些互作位点，筛选特异的中和抗体或抑制剂，阻碍病毒表面的蛋白或多糖与细胞表面受体的结合，从而阻断病毒的入侵途径，将病毒隔离在细胞之外。

另一种方式是针对病毒增殖过程，通过筛选特异的抑制剂，阻断病毒核酸的复制、蛋白的合成或病毒的组装，从而阻断病毒在细胞内的增殖，达到治疗的效果。

2020 年 3 月 30 日，Nature 在线发表了清华大学王新泉教授团队的研究成果，他们解析了新冠病毒 Spike 蛋白受体结合结构域与人受体蛋白 ACE2 复合物 2.45 埃的高分辨率晶体结构，并准确定位了新冠病毒 RBD 和受体 ACE2 的相互作用位点，揭示了受体 ACE2 特异性介导新冠病毒细胞侵染的结构基础。在这篇文章中研究人员利用 Biacore 分别检测了新冠病毒和 SARS 病毒的 Spike 蛋白 RBD 与 ACE2 受体的相互作用，结果表明新冠病毒与受体的亲和力要高于 SARS 病毒。而且从动力学数据可以看出，这种亲和力的差异主要是由解离速率引起的（图 1）。

图 1. Biacore 检测 ACE2 与 SARS-CoV-2（左）和 SARS-CoV（右）的亲和力和动力学

有了上述研究成果，在搞清楚「锁」的结构后，「钥匙」就能设计起来了。

他们首先用 Biacore 验证了筛选到的这些抗体和靶点结合的特异性。结果显示这些分离得到的抗体与新冠病毒 RBD 的 亲和力（Kd）都比较强，在 10^-8M 到 10^-9M 范围内，并且这些抗体只特异性结合 SARS-CoV-2 的 RBD，与 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的 RBD 没有交叉反应（图 2），与血浆和细胞实验结果完全吻合。这也解释了为什么之前分离的 SARS 病毒的抗体对新出现的新冠病毒没有中和作用。

图 2. Biacore 检测分离得到的抗体与 SARS-CoV-2 RBD 的亲和力和动力学

Biacore 竞争实验结果表明，有两个抗体 P2C-1F11 和 P2B-2F6 能够以近 100% 的效率与 ACE2 竞争和 SARS-CoV-2 RBD 结合，具有潜在的中和活性（图 3）。这与假病毒中和实验结果完全一致（表 1）。在竞争实验中，Biacore 特有的管路进样的设计和连续进样的模式（dual injection），能够实现两种样品连续无缝进样，方便研究人员设计各类竞争实验，获得可靠全面的数据。

图 3. 抗体和 ACE2 竞争结合 SARS-CoV-2 RBD 的 Biacore 检测结果

表 1. 抗体和 RBD 亲和力、与 ACE2 竞争效率以及假病毒中和实验结果

随后研究人员选择了 6 个竞争效率高于 70%，具有潜在中和活性的抗体，并利用 Biacore 对其抗原结合表位进行了深入探索。结果表明，这些抗体之间都有不同程度的竞争，例如 P2C-1A3 和 P2B-2F6 几乎与所有检测的抗体都存在明显的竞争，而 P2C-1F11 与 P2C-1C10 之间几乎没有竞争（表 2，图 4）。说明这些抗体所识别的抗原表位既有重叠又有不同，证实这些抗体中和病毒的机制可能有所不同。

表 2. 针对 SARS-CoV-2 RBD 表位分析的 Biacore 结果

图 4. Biacore 对不同抗体结合的抗原表位分析结果

图 5.Biacore 验证 DIP 与靶点 Mpro 的亲和力

图 6. Biacore 检测抑制剂 S312 和 S416 与 DHODH 的亲和力和动力学

作为分子互作技术的「金标准」，Biacore 除了能够同时提供亲和力和动力学数据之外，还有非常高的灵敏度，并且对于检测样品的分子量没有下限。作为小分子抑制剂，S312 和 S416 的分子量都很小，结合的信号都非常低，这对检测方法的灵敏度提出了很高的要求，特别是 S312 与靶点 DHODH 互作的最大响应信号不到 5RU，这么低的信号几乎用其他的方法都无法检测。充分体现了 Biacore 极高的灵敏度在小分子药物筛选、表征及优化中不可替代的重要作用。