2020-03-14 19:26:11, Zhang Lixiang Cytiva(思拓凡)
PREFACE
前言
细胞培养灌流过程被认为是一个真正集成的连续性生物制造管线的最佳选择。而一款营养丰富且均衡的灌流培养基就显得十分重要,它不仅要支持较低的单个细胞灌流速率(CSPR)以此来最小化培养基的消耗,从而减少设备费用、实验场地以及产品的稀释。
另外也要最大化活细胞维持的时间和蛋白产率。最后,在非常低的 CSPR 下工作,将使哺乳动物细胞的生物过程在未来成为真正的恒化培养。
在本研究中,我们展示了使用 Scale-down 模型进行高效灌流培养基开发的一般流程,采用 Spiked-batch 的形式,将补料培养基适量添加到基础培养基中,以此增加灌流培养基的营养。
并通过 DoE 的手段对 Spiked-batch 培养基中所添加补料培养基进行筛选、浓度优化等,最终在 CSPR 为 20 pL/cell/day 的情况下将过程放大到 50 L 规模。
No.1
材料和方法
Cell line:表达 IgG1 的 CHO-K1
基础培养基:HyClone CDM4NS0、HyClone ActiPro
补料培养基:Cell Boost 1-6 以及 7a 7b
图1 用于高效灌流培养基开发的 HyClone 补料培养基 Cell Boost 系列(ADCF)
Step1 和 2:DoE 实验
水平定义:
▸ Level -1:不添加补料
▸ Level 0:最大补料量的一半
▸ Level +1:最大补料量后渗透压为 400 mOsm/kg
【DoE 矩阵的建立和数据分析来自于 MODDE 软件】
Step2 和 3:半连续 Scale-down 灌流模型
初始VCD为 10×106 cells/ml,培养体积10 ml,每天离心(300 g,7 min)换液一个工作体积,如需可进行bleeding。
培养条件为:
▸ 科耐摇床 220 rpm(轴距 50 mm)
▸ 7% 二氧化碳分压
▸ 85% 湿度
▸ 培养温度 37 度
Step4:反应器验证
优化后的CDM4NS0或者ActiPro灌流培养基,在ReadyToProcess WAVE™ 25或者Xcellerex™ XDR 50反应器上进行实验:
▸ 密度为1×106 cells/ml的细胞接种于未优化的基础培养基CDM4NS0或者ActiPro中
▸ Day2 和 Day4 分别灌流 500 ml 和 40 L 培养基
▸ 培养条件为 DO 大于 30%
▸ pH 为 6.8-7.0
▸ 温度 37 度
图2 灌流培养基开发的快速流程(初始基础培养基定义后,八个不同的补料培养基被用于高效灌流培养基的筛选、优化以及验证测试)
No.2
结果分析与讨论
在第一步筛选中(图2,Step1)得出 Cell Boost1、3、7a 以及 7b 是对结果有利的补料。
在 Step2 中得出合适的补料添加比例,结果列于图3,最大VCD达到 50×106 cells/ml,添加补料后的基础培养基(优化后的灌流培养基),提高了细胞活性以及每天的蛋白产量达到 1 g/L。
图3 DoE2 在半连续 Scale-down 模型中筛选早期选择的 Cell Boost 补料(使用回归分析定义最后的灌流培养基)
Step3 在半连续 Scale-down 模型中评估了不同 bleeding 比例对结果的影响,如图4,bleeding 比例越高,维持的生长速率越高;
同时,随着 bleeding 的比例从 20% 提高到 30%,产物的比生产率也得到了提高,但在半连续 Scale-down 模型中,培养后期半乳糖基化的水平有所下降。
图4 每天 Bleeding 对培养结果的影响(半连续灌流培养时,更换培养基前每天移除 20%-40% 的细胞液)
在 Step4 中,两款基于 CDM4NS0 和 ActiPro,以及补料 CB1 和 3(补料添加量约为 30%)的新型灌流培养基,在不同规模的反应器上进行验证,如图5。最小当 CSPR 为 10 pL/cell/day 时,MVCD 达到 200×106 cells/ml;
同时,培养后期有着较高的半乳糖基化修饰水平,对比半连续 Scale-down 模型和反应器之间的差异(图7),发现可能的原因是由于在 Scale-down 模型中有较高的氨积累。
图5 优化后的灌流培养基应用于不同的反应器中(优化后的 CDM4NS0 或者 ActiPro 灌流培养基应用于 500 ml ReadyToProcess WAVE 25 或者 50 L 的 XDR 50 反应器,VCD=viable cell density; vvd=media volume per bioreactor volume per day)
图6 不同灌流条件下的产品质量
图7 Scale-down 模型和反应器灌流培养的对比(Bleed 速率 30%)
总结
一个基于DoE方法的高效灌流培养基的开发流程
半连续Scale-down模型用于高效灌流培养基不同实验条件的的筛选。
最小使用CSPR为10 pL/cell/day的条件,在WAVE 25中得到 200×106 cells/ml的细胞。
稳定的灌流过程可以放大到XDR 50 L规模。
反应器中的产品半乳糖基化比例高于半连续的Scale-down模型,可能是由于Scale-down模型中较高的氨累积。
在bleed条件下,关键培养参数在Scale-down模型和反应器之间十分相近。
参考文献
Perfusion media development for scalable process. Patrick Mayrhofer, et al. GE Healthcare
注:公众号转载请在后台回复“转载”,获得授权后按要求进行转载,违者必究。
任何专业问题请留下您的联系方式
或通过以下途径与我们联系
智荟专线:
400-810-9118(手机)
800-810-9118(固话)
(全国免费服务热线)
邮箱:
akta.club@ge.com(Ä 爱纯派)
cell.club@ge.com(Cell fun club)
lifesciences@ge.com(其他)
官网:
www.gelifesciences.com.cn
07-01 英斯特朗
连载 | 药物一致性评价与粒度分析(三)07-01 欧美克仪器
【仪器百科】LS-909丨干湿二合一激光粒度分析仪07-01 欧美克仪器
标准物质解决方案 | PFASs(全氟及多氟化合物)06-29
第九期阿尔塔有约 | 环境专题【新污染物:PFAS】技术研讨会精彩回顾及提问解答06-29
“绿色技术范式”,分析化学未来发展方向——访中国分析测试协会副理事长、辽宁省分析科学研究院原院长刘成雁教授06-29 转载仪器信息网
华西医院-标准型数显脑立体定位仪、双通道体温维持仪、体式显微镜安装完成06-29 迈越生物
科鉴检测助力2家仪器企业获得首批产品可靠性认证证书06-28 科鉴检测
德国耶拿:锂电池生命周期分析解决方案06-28 德国耶拿
AI已来!生命科学本科教学如何紧跟技术浪潮06-28 Opentrons
盛瀚售后,五星级服务的秘诀是什么?06-28 SHINE
专为汽车制造商打造的柔性解决方案——实现制程控制06-28
西北工业大学-脑立体定位仪安装完成06-28 迈越生物
会议邀请 | 第九届海上检验医师论坛06-28
卓立要闻 | 创新发展ing…6月卓立“大事小情”速览06-28 光电行业都会关注
打造信任合作伙伴!2024年度卓立汉光客户满意度调查开启06-28 光电行业都会关注
如何挑选适用于三阶光学非线性的测量系统?Z扫描测量系统来助力!06-28 光电行业都会关注
招聘启事—中国科学院沈阳自动化研究所微纳光学测量表征技术课题组06-28 光电行业都会关注
谱育科技作为主要完成方 荣获2023年度国家科学技术进步一等奖和二等奖06-28 点击关注→
仪器原理丨顶空仪与吹扫捕集仪科普小知识06-28 天美色谱