样品纯化时，如何区分和应用Flash反相色谱和高压液相制备？

在过去的十几年间，随着Flash快速色谱持续被广泛的应用，反相Flash和高压制备同样都是用于样品纯化，如何在两者之间进行选择的问题在不断地被提及，化学家们往往对于如何打通化合物的合成路线比较在行，但对于分离领域的相关应用却没有太熟悉，很多情况下，大家对于Flash和制备HPLC之间的区别还不甚了解，今天我们和大家谈谈Flash和制备HPLC之间的联系以及相关的应用。

我们都知道，当咱们的合成实验室的样品需要纯化时，往往直接进行手动过柱就可以拿到目标产物，大部分此类样品都比较容易分离，非常适合于使用Flash进行快速分离，而对于剩下的一些难分离的化合物则需要借助于制备液相分离，此类样品往往需要耗费更多的时间和精力。当产物的纯度成为最重要的考虑对象时，如纯度需要达到99%以上，此时则往往需要借助于高压制备液相，通过多次进样来实现目标物的富集。或者也可以将Flash和高压制备结合起来进行：前期通过Flash进行粗产品的粗集，将纯度提高到95%以上，最后一步再通过高压制备进行精纯，最终达到所需纯度；面对高纯度目标样品时，此种方案正逐步成为主流，由于前期通过Flash进行大量富集后，样品纯化和上样量都可以大大提高，不仅速度上有大幅度提升，对于设备和制备柱的使用寿命也可大大延长。

对于高压制备液相而言，其基本上是用于最终产物的纯化，或者是帮助解决Flash无法胜任的纯化问题。

那么是否所有的最终产物的纯化都需要高压制备液相呢？

然后并不是，随着技术的进步，Flash已经可以解决市面上相当一部分的最终样品的纯化工作。

如今Flash所使用的色谱柱柱效正逐年提高，可以达到很高的载样量和纯度，同时和Flash相比，高压制备的设备和运行成本是Flash的2-3倍，高压制备色谱往往使用5-10um的细颗粒填料，需要装载在高精度的不锈钢柱套当中，持续的高背压对设备的持续运行要求很高，同时维护费用也会很高。

高压制备柱由于其细颗粒填料的运用，在不过载条件下，可以产生高纯度的馏分，然后其柱效收到上样量的影响确实最大的，如下图：

图1：不同粒径填料下，载样量对柱效的影响表明，较小粒径填料的柱效下降速度快于较大粒径填料。

这个图片所展示的相关信息可能和大部分的想法有一些出入，然后这是事实，

根据如下公式，可以发现载样量和柱效的平方根成正比，

M_i = [A_m*(1.9*r²*L)*(1+k)]/ n^½

M_i =载样量

A_m =常数

r² =色谱柱半径

L =色谱柱长度

k =化合物的相对保留系数

n =柱效（塔板数）

所以可以发现，塔板数越高，载样量反而越低， 这也是制备色谱通常使用较大颗粒填料的原因之一。比如在很多的高压制备系统当中，往往都是使用10um填料，使用5um填料的系统则是凤毛麟角。

图2。色谱柱的载样量随着填料粒径的增大而增大。

因此在纯化过程中，柱效不一定是唯一要考虑的因素，往往我们也需要考虑上样量以及相应的纯度和产率要求。

另外同样的C18色谱柱，键和效果的好坏也会影响分离的效果，毕竟色谱柱的选择性的优劣也是评判分离效果的重要指标。BiotageC18色谱柱拥有超高键和效率，我们在实验室当中用其进行了对比实验。

首先我们将一个含有五种化合物的样品通过一根4.6 x 150 mm, 5 µm, C18 色谱柱进行分离测试，将样品溶解在DMSO中进行液体注射，上样量为0.17ug，其上样率仅为0.01%，通过一个50%-90%甲醇/水体系的梯度方法后，得到如下谱图：

图 3. 4.6 x 150 mm, 5 µm C18得到的分析图谱，其中一组峰没有完全分开，第一个峰为DMSO(1.82 分钟)。

以上化合物如果放大100mg进行分离，则需要一根更大更昂贵的高压色谱柱进行分离。

对于Flash而言，其反相C18载样量有时候甚至可以达到1-2%，或许此时我们可以通过Flash来代替昂贵的昂贵的高压系统和色谱柱，帮助解决纯化难题。

于是我们进行了同样方法的Flash放大尝试，所使用色谱柱为 Biotage® Sfär C18  12g，通过同样的HPLC方法分离同样的样品，由于载样量提升，我们将粗品量提升到100mg，得到的分离谱图如下；

图4：通过Flash进行100mg粗品所得分离谱图，所使用色谱柱为12g Biotage® Sfär C18系列。

结果显示，五种产物都得到了完美分离，这完全出乎大部分人的意料，可以发现Flash也帮助解决了需要高压色谱柱进行样品制备的问题。

而对于同样100mg的样品，我们至少需要一根10×250mm 的高压制备柱进行分离，其价格需要15000 RMB以上，而我们的C18色谱柱仅需要其1/10的价格即可完成，性价比十足。

当然对于极难分离化合物而言，高压制备液相仍然是目前最理想的选择，而样品量增加时，此时单一的机器则需要借助于辅助多次进样来提供产量，一方面速度放慢，一方面也增加了运行成本；或则此时您可以选择通过Flash 的反相纯化技术帮忙一次性进行大批量的样品纯化。希望此次的案例分享可以给您带来更多的分离思路和经验。