梯度洗脱 VS 等度洗脱？

2023-02-14 10:34:50, Biotage 拜泰齐贸易（上海）有限公司

在样品纯化分离的过程中，梯度洗脱或者等度洗脱的两种分离方法之间的选择一直都是样品处理过程中比较常见的问题，两种方法的选择经常出现在反应混合体系分离纯化以及天然产物样品提取的过程中，本文以此展开讨论和研究。

等度洗脱意味着在整个色谱分离过程中，用于进行纯化的流动相混合物，从始至终保持着相同的极性和比例（强极性和弱极性溶剂之间），比如10%EA/PE。如果使用薄层色谱法（TLC）作为快速色谱法的基础，等度洗脱可以更加真实的还原TLC薄层板上面所展示的极性和样品分离情况。

而对于梯度洗脱而言，其起始流动相溶剂比例和结束时的溶剂比例则不同，通常是通过梯度法从弱溶剂百分比较高的流动相开始，以强溶剂百分比较高的流动相结束。

在实际应用过程当中，梯度洗脱还可分为两种类型的梯度方式，即线性（梯度）和阶梯式（梯度）。它们有自己的优点，我随后将加以讨论。

1. 等度洗脱

如前所述，等度洗脱是使用固定的溶剂混合比例来分离和洗脱样品的成分。等度洗脱很简单，但确实也存在一些缺点，其最大的缺点就是是色谱峰出现变宽或拖尾。当粗品在色谱柱中进行吸附和解吸附的相互作用时，对固定相具有较大吸附力的的化合物，比对流动相亲和力更大的化合物洗脱更慢。由于流动相浓度和极性没有变化，因此其在色谱柱中所消耗的时间会明显大于流动相极性逐渐增加的洗脱方法，时间越长，其峰宽越大，同时该样品所消耗的溶剂也就越多，从而增加了纯化该样品所消耗的溶剂和时间，我们将此现象命名为：稀释效应，伴随着色谱带加宽，如图1所示。

图1.等度洗脱色谱法。消耗了更多的洗脱体积，形成了更宽的色谱峰

2. 梯度洗脱

在梯度纯化过程中，通过改变流动相的洗脱强度，增加了后期洗脱化合物在流动相中的溶解度和浓度，从而加快其洗脱。通过这种做法，后面的洗脱极性永远比前面高，增加了样品的浓度，同时样品色谱峰的峰宽也会进一步变窄，减少溶剂消耗，提高效率，同时梯度洗脱还可以提高样品分离量，从而进一步增加样品处理量以及可以得到高纯度的馏分。

梯度洗脱分为两种常用的梯度，线性（梯度）和阶梯式（梯度）。在线性梯度下，溶剂比例会进行线性增加，加快了极性大样品化合物的洗脱，并改善了分离效果，如图2。

图2. 线性梯度洗脱。随着洗脱溶剂强度的增加，化合物洗脱带减少，从而提高纯化效率。

而阶梯式梯度则是由一系列度等洗脱组合而成。（想想楼梯就可以直观感受阶梯式梯度“样貌如何”）每个连续步骤都是不同的溶剂比，包含较高百分比的强溶剂，如图3。阶梯式梯度背后的思路是尽可能控制个别化合物的洗脱条件，以最大限度地实现化合物之间的分离。此外，阶梯式梯度的一个显而易见的优点是减少了进行纯化所需的溶剂量。