西奈山伊坎医学院Schlessinger团队JACS论文：靶向PKMYT1隐藏变构位点的新型抑制剂及其结合机制转换

激酶药物研发长期受困于ATP正构口袋高度保守带来的脱靶毒性与耐药瓶颈。为此，靶向蛋白动态运动中瞬时开启的“隐蔽口袋（Cryptic Pocket）”，已成为实现激酶极致选择性的关键策略。然而，这些变构位点生命周期极短，难以被常规结构生物学手段捕获或现有计算模型预测，是当前药物发现的一大挑战。

作为WEE1信号通路的重要成员，PKMYT1通过磷酸化CDK1参与G2/M期细胞周期检查点的调控。由于其在多种肿瘤中发挥着关键的生物学功能，PKMYT1被视作极具潜力的新型抗肿瘤靶点。然而，截至目前，针对PKMYT1的药物研发主要集中于传统的ATP结合口袋，学界对其构象的动态变化及潜在的变构调控机制仍处在探索初期。针对这一难题，西奈山伊坎医学院 Avner Schlessinger 团队对 PKMYT1 的动态构象进行了深度采样，成功捕捉到一种前所未见的隐蔽变构状态，相关研究成果近日发表于化学领域国际顶级期刊之一Journal of the American Chemical Society 上【1】。

在基于结构的药物设计流程中，如何突破晶体学静态构象的局限，进而有效捕捉到蛋白质在溶液中瞬时存在的隐蔽口袋，是变构抑制剂发现的核心技术难关。得益于人工智能驱动的结构预测技术的发展，研究团队首先利用ColabFold平台对AlphaFold2（AF2）模型进行了参数维度的创新性改造。为了削弱默认模式下模型因过度拟合多序列比对（Multiple Sequence Alignment, MSA）深度而产生的对保守高频构象的强烈偏好，他们将最大MSA深度限制至“max_msa = 8:16”的稀疏区间，并通过增加迭代次数并开启训练模式，研究团队成功拓宽了模型对动态构象空间的采样边界。

图1：蛋白激酶催化域的经典正构/非经典变构结合口袋(A/B)与PKMYT1激酶域的大尺度失活构象空间采样图（C）。

在这项精细的构象模拟推演中，研究团队在生成的上千个多样化模型中遴选出了一个预测置信度高（pLDDT = 78.93）、且处于独特“DFG-out”失活构象的PKMYT1激酶域模型。在该特定模型中，一个崭新的隐蔽疏水性口袋出现在激活环（Activation Loop）与催化核心附近的αC螺旋之间。以此理论模型为靶向结构基础，研究人员迅速在Schrödinger软件平台中调用Glide SP分子对接算法以及OPLS_2005原子自洽力场，对包含多达400万个先导物分子库的ZINC20 Lead-Like数据库进行了高通量的计算机虚拟筛选(激酶经典结合构象分类及失活构象空间采样如图1所示)。

图2： 从初筛命中物P13到高活性分子P32-(S)的构效关系演化历程。

为滤除“假阳性”分子，研究团队结合k-means聚类与人工复核（聚焦与Asp251的氢键作用），最终挑选25个化合物进行湿实验。初筛获得命中化合物P13（25 μM下置换率24%，化合物结构如图2所示），经构效关系优化后得到活性更强的P29（IC50 = 56.2 μM）。高分辨率共晶结构（2.22 Å）与动力学分析证实：P29精准嵌入预测的全新变构口袋，并迫使P-loop向外翻转。这种空间位阻直接阻断了ATP的结合，展现出罕见的混合型抑制机制（化合物P29与蛋白结合模式如图3所示）。

图3：小分子P29共晶结构及其强制推开P-loop环、物理阻断底物结合的特异性失活机制。

为进一步提升该系列化合物的抑制活性，研究团队围绕P29骨架开展了结构优化。基于分子对接结果，研究人员将苯环对位羟基调整至间位，希望与Asp150形成更有利的氢键相互作用。该策略最终获得对映异构体P32-(S)，其体外酶学活性提升至IC50 = 1.6 μM，活细胞NanoBRET结合活性为3.4 μM（图4A）。虽然相较母体化合物P29取得了明显改善，但其整体活性水平距离当前高效激酶抑制剂常见的纳摩尔级范围仍存在一定差距。

然而，2.20 Å的高分辨率共晶结构却揭示了出人意料的结合模式。电子密度图表明，优化后的P32-(S)完全脱离了母体的N-lobe变构槽，转而嵌入常规的ATP正构口袋，转变为标准的Type-I竞争性抑制剂。在正构结合状态下，P32的核心刚性杂环骨架与激酶铰链区关键残基Cys190的主链酰胺形成了经典的双向氢键；原本设计用于变构结合的间位酚羟基，则因分子位移精准地与催化核心DFG基序的Asp251侧链羧基建立了强极性氢键（如图4B所示）。伴随这一口袋跨越，由P29诱导的P-loop外翻构象完全消失，激酶骨架恢复为高度刚性且紧凑的经典结合姿态。

图4：P32在正构ATP口袋深处的经典Type-I互作共晶图谱（A）及体外置换活性曲线。

小编认为该项研究颇具幽默感：研究团队通过人工智能构象采样发现了一处此前未知的隐蔽变构口袋，并以此为起点展开药物设计。然而，随着活性不断提升，化合物却逐渐偏离最初发现的变构位点，最终以ATP竞争性抑制剂的形式达到最佳活性。某种意义上，研究中最成功的药物化学优化并未强化最初提出的变构作用机制，反而回归到了激酶领域最为成熟和常见的ATP结合模式。这一现象提示，隐蔽口袋的发现只是药物发现的起点，而其能否经受后续优化过程的“筛选”，仍是评价其成药价值的重要标准。

从药物发现角度来看，P29距离真正具有开发价值的变构抑制剂仍有相当距离，其活性、选择性以及变构结合模式的稳定性仍有待进一步验证。本研究留下的最重要问题或许并非“能否发现新的隐蔽口袋”，而是“如何将这些瞬时出现的构象状态真正转化为可持续优化的药物结合位点”。P32-(S)从变构位点回归ATP口袋的现象提示，隐蔽口袋的发现与其成药性潜力的确立之间仍存在不小距离。未来，如何在保持变构结合模式的同时进一步提升活性与选择性，将是检验这一策略实际价值的关键。

参考文献