变黄、变粉？蛋白原液颜色形成机理与上游控制策略

2026-07-27 11:31:28, Li Ruyu Cytiva（思拓凡)

近年来，随着皮下注射制剂和高浓度DS（Drug Substance，原液）越来越常见，蛋白颜色问题正受到越来越多关注。对于注射用蛋白药物而言，颜色不仅是外观属性，更可能反映氧化修饰、糖化反应、金属离子作用及氧化还原状态变化等质量风险。颜色的变化往往是工艺状态极为直观和敏感的信号之一，也逐渐成为工艺开发和质量研究中的重要关注点。

WHY

为什么要关注蛋白颜色？

根据药典要求，注射用蛋白药物需满足外观和颜色一致性要求。颜色已被纳入产品质量评价体系，属于重要的产品外观属性。

但相比法规要求，更值得关注的是，蛋白颜色往往关联着蛋白自身质量变化。不同颜色背后可能对应不同的潜在风险，例如黄色可能与Trp氧化相关，棕色可能与糖化及AGE形成相关，粉红色可能与VB12结合及二硫键还原相关，而棕红色则可能提示金属离子络合。颜色加深也常常意味着ROS升高和氧化应激增强。

图1. 培养基组分、ROS与翻译后修饰共同驱动DS颜色形成

从目前公开报道来看，蛋白颜色形成主要涉及三条路径：ROS介导的Trp氧化、AGE相关糖化修饰，以及VB12结合导致的粉红色显色。其中不同机制往往并非独立存在，而是在培养过程中相互影响、共同作用。

WHAT

蛋白颜色是如何形成的？

机制一

Trp氧化——黄色和黄褐色的重要来源

色氨酸（Trp）氧化是蛋白药物黄变或褐变中非常常见、需要优先排查的机制之一。

在细胞培养、纯化、储存或光照过程中，ROS、金属离子和光照都可能促进Trp氧化。Trp经多步氧化后可形成犬尿氨酸（Kyn）、N-甲酰犬尿氨酸（NFK）等有色降解产物，这些产物会使蛋白溶液呈现黄色或黄褐色。

铁离子在这里扮演了一个“双刃剑”角色：一方面，铁是CHO细胞生长和代谢所需的重要微量元素；另一方面，铁也可能参与Fenton反应，促进ROS生成，从而增加氧化应激和产品颜色风险。

因此，看到黄色或黄褐色DS时，不应只问“颜色能不能去掉”，而要进一步追问：

是否存在Trp氧化升高？

是否存在高铁培养基或铁源差异？

是否有光照、ROS或长期高密度培养带来的氧化压力？

颜色变化是否伴随酸性变异体增加？

图2. Trp氧化可生成Kyn和NFK，推动蛋白溶液黄变或褐变

机制二

AGE糖化——容易被低估的棕黄色来源

并不是所有棕黄色都来自氧化。AGE（Advanced Glycation End Products，高级糖化终产物）也是一个重要来源。

在CHO细胞培养过程中，还原糖或碳水化合物降解产生的二羰基副产物，可与蛋白质赖氨酸、精氨酸或N端氨基发生非酶促反应，逐步形成AGE。部分AGE产物具有可见光区吸收或荧光特征，可能导致蛋白呈现黄色至棕黄色。

有研究通过质谱分析不同颜色强度的CHO来源重组抗体，发现多个AGE修饰与产品颜色呈强相关，其中CML（ε-羧甲基赖氨酸）进一步通过ELISA得到验证，提示AGE至少部分参与了CHO来源抗体的颜色形成。

这意味着，颜色分析不能只停留在“氧化”一个维度。对于高糖补料、长周期Fed-batch、高密度培养或糖代谢压力较大的项目，应同时考虑：

还原糖暴露时间

补糖策略与残糖水平

AGE或CML水平

酸性变异体变化

氧化与糖化是否存在协同效应

图3. 高级糖化终产物（AGE）引起颜色变化

机制三

VB12/OH-Cbl——粉红色的关键线索

与黄色、棕色不同，粉红色往往更“显眼”，也更容易引发客户关注。

培养基中的维生素B12（钴胺素）存在多种形式，其中氰钴胺（CN-Cbl）最稳定，而羟钴胺（OH-Cbl）则被认为是导致蛋白显色的关键分子。研究表明，培养基中的CN-Cbl在光照条件下会逐渐转化为OH-Cbl，而OH-Cbl能够与蛋白发生结合，从而赋予产品粉红色外观。

这解释了一个常见现象，培养阶段看起来正常，但培养基、补料或中间体经历光照暴露后，最终产品可能出现发粉。

需要注意的是，

仅有VB12或仅有OH-Cbl本身并不一定导致产品发粉。Derfus GE等2014研究发现，粉红色形成还需要另一个重要条件——抗体发生二硫键还原。只有当“还原态抗体”和“羟钴胺（OH-Cbl）”同时存在时，最终产品才会呈现典型的粉红色。

因此，除了培养基成分之外，Harvest过程同样是颜色控制的重要环节。

对于VB12相关颜色风险，重点不是简单地问“培养基里有没有B12”，而是要问：

B12以什么形式存在？

培养基和补料是否避光？

是否存在CN-Cbl向OH-Cbl转化？

收获后体系是否长期处于强还原环境？

细胞破裂是否增加？

图4. OH-Cbl是VB12相关粉红色形成中的关键结合形式

HOW

上游如何控制蛋白颜色？

颜色控制的核心不是“颜色出来后再处理”，而是尽量在上游和Harvest阶段减少颜色形成。颜色控制不是单点优化，而是培养基组分、ROS、糖代谢和Harvest氧化还原环境的系统平衡。

上游控制策略速查表

Case

两个典型上游控制案例

Case 1

低铁适应工艺改善DS颜色，同时恢复Titer

铁离子是颜色控制中的典型矛盾点，高铁可能提升细胞生长和表达，但同时也会增加颜色形成风险。为了降低DS风险，研究人员设计了不同铁离子浓度的培养工艺，并结合长期Seed Adaptation（种子细胞适应）进行优化比较：

其中P20代表细胞已经历长期低铁适应培养。

结果1

铁离子浓度升高导致DS颜色逐渐加深。如图5所示，在10 μMFe条件下，DS呈现浅黄色；随着铁浓度增加至20、30、50及110 μM，颜色逐渐加深，由浅黄色向浅棕色转变，提示铁离子水平与产品显色风险呈正相关。虽然铁离子并非直接显色物质，但其诱导的ROS积累可促进Trp氧化，进而形成Kyn和NFK等有色降解产物。

图5. 不同铁离子浓度下DS颜色变化

结果2

长期低铁适应恢复细胞生长和表达能力。如图6，直接降低铁离子虽然能够改善颜色，但研究人员发现，早期低铁工艺（Process A）会出现活细胞密度（VCD）降低和蛋白表达量（Titer）降低的现象，因此研究团队进一步采用长期低铁适应策略，让细胞在20 μM铁离子条件下连续传代至P20。结果显示，Process B在保持较浅DS颜色的同时，VCD和Titer恢复至接近高铁工艺水平。

图6. 低铁适应后细胞生长与表达恢复情况

该案例的关键启发是：

1. 直接降低铁离子可以改善颜色，但可能牺牲细胞生长和表达。

2. 长期低铁适应可帮助细胞在低铁条件下恢复较好的生长和生产能力。

3. 颜色控制必须与VCD、Titer、charge variants和其他CQA联合评估。

Case 2

收获阶段二硫键驱动的VB12发粉机制及控制策略

另一个典型案例来自IgG4产品的红色/粉红色问题。

如图7，研究人员比较了正常收获条件（C-HCCF）和促进还原条件（RP-HCCF）下的产品颜色变化。结果显示，即使培养基中含有相同浓度的VB12，只有在发生二硫键还原的条件下，最终产品才出现明显粉红色。这说明VB12本身并不是唯一决定因素，真正的发粉机制是培养基中的VB12与收获阶段二硫键还原共同作用。

图7. 收获阶段二硫键还原导致产品发粉，A-C：正常Harvest（C-HCCF）E-G：Reduction-promoting Harvest（RP-HCCF）D和H在还原前后加抗阻剂

进一步分析发现，当收获过程中细胞破裂增加时，LDH水平升高。LDH本身并不是导致发粉的原因，而是细胞破裂的标志物。真正关键的是，细胞破裂后会释放大量胞内还原体系，包括GSH、Trx和Grx等。这些还原剂会促进抗体二硫键断裂，生成更多游离巯基，从而增加OH-Cbl与抗体结合的机会。因此，收获过程中细胞破裂越严重，产品发粉风险越高。

图8. 谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统介导抗体二硫键还原

更重要的是，研究表明收获后体系的氧化还原状态并非不可逆，而是可以通过工艺操作进行调控。研究比较了重新通气（Re-aeration）与未通气条件下产品状态的变化。如图9，结果显示，在未通气条件下，培养液DO在2天内迅速降至接近0%，体系逐渐进入强还原环境；而重新通气后，DO始终维持在较高水平，完整抗体比例保持稳定，二硫键降解明显受到抑制。

图9. 通气可逆转收获阶段的还原环境

该案例的关键启发是：

在实际工艺中，Harvest阶段可能通过以下路径放大发粉风险：

1. 细胞破裂增加；

2. 胞内还原体系释放；

3. 抗体二硫键还原；

4. 蛋白构象或结合位点暴露；

5. OH-Cbl与蛋白结合；

6. 最终DS呈现粉红色或红色。

对应的控制策略也应前移到收获阶段：

缩短Harvest Hold

降低过滤剪切和压力

控制收获液温度和DO

监测LDH或细胞破裂指标

监测完整抗体比例

必要时评估通气或氧化还原调控

Conclusion

颜色是工艺状态的指示灯

从Trp氧化导致的黄变，到AGE糖化带来的棕黄色，再到VB12/OH-Cbl与二硫键还原共同驱动的发粉，蛋白颜色并不是一个简单的外观现象。

它更像是培养体系、培养基组成、氧化还原状态和分子修饰共同留下的工艺指纹。

对于上游工艺开发人员而言，颜色真正值得关注的，不只是“这一瓶是不是更黄、更粉”，而是它背后提示了什么：

是否有ROS升高？

是否有Trp氧化或AGE增加？

是否存在VB12/OH-Cbl结合？

Harvest阶段是否发生二硫键还原？

培养基组分是否需要重新平衡？

颜色变化是否伴随其他CQA变化？

相比在下游阶段尝试“去除颜色”，更有效的策略往往是在上游和Harvest阶段提前预防：优化培养基组分、控制ROS、管理光照暴露、降低糖化风险，并稳定收获阶段氧化还原环境。

颜色不是结果，而是信号；不是终点，而是工艺状态的直观指示灯。

当蛋白原液开始变黄、变棕或发粉时，它提醒我们的可能不是一个外观问题，而是一条值得追踪的工艺线索。

延伸阅读：见本期另一篇文章《同样是VB12，为什么供应商A和B颜色不同？》，本文进一步通过VB12供应商对比案例，分析原材料粒径、晶型及颜色差异对培养基外观的影响。

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参考文献

[1] Shukla AA, et al. The Different Colors of mAbs in Solution. BioProcess International, 2017.

[2] Kosky AA, et al. Brown drug substance color investigation in cell culture manufacturing using chemically defined media: A case study. Biotechnology Progress, 2021.

[3] Borys MC, et al. Recombinant Antibody Color Resulting from Advanced Glycation End Product Modifications. Molecular Pharmaceutics, 2020.

[4] Prentice KM, Gillespie R, Lewis N, et al. Hydroxocobalamin association during cell culture results in pink therapeutic proteins. MAbs, 2013, 5(6):974–981.

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[6] Kosky AA, Tarcsa E, Chellew NR, et al. Improving titer while maintaining quality of final formulated drug substance via optimization of CHO cell culture conditions in low-iron chemically defined media. Biotechnology Progress, 2021.