实验干货：类器官多维鉴定操作指南 (文末申领试用装~)

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类器官

类器官的构建提供了最为简化也最易获取的“最小器官”,通过 HE 染色病理学分析、免疫组织化学法、免疫荧光法、基因测序等方式,不仅能够确定类器官表型与靶器官的一致性,确认类器官生物标志物的表达水平,还能够明确类器官内的细胞身份信息、定位类器官内不同细胞类型的位置信息等,综合评价类器官与原始器官的同源性,从而保证类器官能准确代表人体器官的结构和功能^[1]。

图 1. 类器官的鉴定方法^[1]。

首先介绍下类器官的固定、包埋、制片等操作步骤，为类器官鉴定提供技术参考。

1. 固定

① 类器官数量：约 1×10⁶ 个细胞 (相当于 24 孔板约 8 孔)。

② 收集：吸弃培养基，每孔加入 1mL 组织清洗液，轻柔反复吹打底部胶体至分散，转移至 15mL 离心管中，2500rpm 室温离心 5min，弃上清。

③ 固定：加入 5mL 4% 多聚甲醛重悬类器官沉淀，4℃ 固定过夜。

2. 石蜡包埋

① 预处理：固定后的类器官，1500rpm 室温离心 5min，弃上清。

② 琼脂糖预包埋 (推荐 2%w/v，低熔点 26–30℃)：琼脂糖 50℃ 溶解后降温至 37℃，与类器官 1:1 混匀，立即吸入平底模具，室温 3min 凝固 → 形成 3–4mm 厚“琼脂圆盘”→ 将圆盘切成 5mm×5mm 小块，边缘直角利于后续石蜡包埋定位。

注意：确保切片平面内 80% 以上类器官处于同一焦面。

③ 脱水-透明-浸蜡：70% 乙醇 1h→80% 乙醇 1h→90% 乙醇 1h→95% 乙醇 1h→100% 乙醇 1h ×3次→二甲苯 1h ×3 次→60℃ 石蜡 Ⅰ 1h→60℃ 石蜡 Ⅱ 1h→60℃ 石蜡 Ⅲ 1h。

注意：

① BME/ 琼脂糖脱水后体积收缩约 20%，脱水不足易导致组织裂隙；

② 二甲苯不宜超过 1.5h ，以免类器官脆性增加而碎裂。

3. 切片

① 包埋定位：琼脂块平放于包埋盒，最宽面朝下，确保切片时先切到最大截面。

② 冷却：−20℃ 1h 或 4℃ 过夜；切片前保持冷台 4℃，防止石蜡软化。

③ 切片：使用轮式切片机，一次性刀片；厚度 4µm；初修面至琼脂层出现透明区后，每切 10 片镜检一次，及时捕捉完整类器官。

④ 展片：42℃ 水浴，正面展片 5s ，避免高温长时间拉伸造成 3D 结构压扁。

4. 烤片与保存

① 烤片：37℃ 过夜干燥，次日 56℃ 二次熔蜡 30 min；

② 保存：−20℃ 避光可保存 6 个月，长期保存建议抽真空或加干燥剂，防止抗原弥散。

那就从类器官的常规鉴定手段——组织病理学开始！HE 染色和免疫组织化学法具有时效快、成本低、普及性高的优势，可满足类器官检测对时效性的要求^[2]。

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HE 染色分析

1. 切片前质控： 烤片后 56℃ 二次熔蜡 30min，降低脱片率至 <1%。

2. 脱蜡-复水：脱蜡—复水需垂直染色架，每步 250mL，流速 1 滴/s。二甲苯 Ⅰ 10min→ 二甲苯 Ⅱ 10min→100% 乙醇 3min ×2 次→95% 乙醇 3min→ 80% 乙醇 3min→流水轻冲 30s (去除乙醇，防止苏木素沉淀)。

3. 染色：苏木素 (Mayer’s) 5min→ 流水冲洗 1min→ 1% 氨水蓝化 30s→ 流水返蓝 2min→ 伊红 Y (0.5% 醇溶) 45s→ 流水轻冲 5s (镜下控制染色深度，防止过染)。

4. 脱水-透明：80% 乙醇 30s→ 95% 乙醇 30s→100% 乙醇 1min ×2 次→二甲苯 3min ×2 次。

5. 封固：中性树胶 2 滴， 24 × 50mm 盖玻片斜角封片，避免气泡；56℃ 烘箱固化 15min，做好标记室温可稳定保存 5 年。

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免疫组织化学法

1. 脱蜡：切片依次浸入新鲜的二甲苯中浸泡 10min，依次经过三缸。

2. 复水：100% 乙醇 3min× 3 次 →自来水 1min  →PBS 3min× 3 次。

3. 抗原修复 (柠檬酸法)：抗原修复缓冲液加热沸腾后放入切片→压力阀喷气时计时 3 min→室温自然冷却 5min→流水冷却锅中修复液至室温→取出切片，流水冲洗干净。

4. 阻断内源性过氧化物酶：切片放入过氧化物酶阻断试剂，室温孵育 6min →PBS 3min× 3 次。

5. 一抗孵育：切片依次摆放在免疫组化孵育盒中，除去 PBS 溶液，滴加一抗， 37℃ 孵育 60min，PBS 洗涤。

6. 二抗孵育：切片上滴加酶标羊抗鼠/兔 IgG 聚合物试剂，37℃ 孵育 15min，PBS 洗涤。

7. DAB 显色：除去 PBS 溶液，滴加新鲜配制的 DAB 显色液，镜下控制显色时间。

8. 复染与封固：显色结束后，切片插入染色架中→自来水中终止显色→冲洗干净，苏木素中复染→1% 盐酸酒精分化→PBS 返蓝→梯度乙醇脱水→二甲苯透明→中性树脂封固。

9. 成像分析：封闭好的切片做好标记，成像分析。

图2 . 类器官及组织样本免疫组化验证。

A. 乳腺癌 B. 结肠癌。

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免疫荧光法

免疫荧光也可作为类器官鉴定的手段之一，小伙伴们可根据实际需求进行选择。

1. 收集：100g 离心 5min 收集类器官。

2. 重悬：收集到的类器官重悬于 1× PBS 中，转移至 96 孔圆底 (U 型) 板中，100g 离心 5min。

3. 固定：弃上清，加入 4% 多聚甲醛室温固定 30min。

4. 洗涤：移除多聚甲醛，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 100g 离心 5min。

5. 透化：加入 0.3% Triton-X，室温透化 10min。

6. 封闭：加入含有 10% 驴血清的 PBST (0.05% Tween-20)，室温震荡封闭 1h。

7. 一抗孵育：加入稀释后的一抗 (见表 1)，4℃ 过夜孵育。

8. 洗涤：一抗孵育结束后，含有 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤 3 次， 每次 100g 离心 5min。

9. 二抗孵育：加入二抗 (AlexaFluor 555 驴抗兔 1:200、AlexaFluor 488 驴抗小鼠1:200) 及 DAPI (1:1000)，室温避光震荡孵育 2h。

10. 洗涤与封片：含有 0.05% Tween-20 的 PBS 洗涤三次，每次 100g 离心 5min，转移类器官至黑色壁玻璃底的 96 孔板中，保存于含有 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液中，使用共聚焦显微镜成像。

表 1. 类器官相关一抗推荐

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基因检测

与组织病理学相比，基因检测在类器官鉴定方面具有更高的精准度，已被推荐用于肿瘤类器官的基础及转化研究。通过获得肿瘤的基因表达谱，可以更好地捕获肿瘤内及肿瘤间的异质性。

1. DNA 提取

根据试剂盒的说明书从类器官中提取 DNA。快速冷冻的组织放置于 160μL PBS 中，通过不锈钢珠在组织裂解仪中匀浆 (20Hz，2min ×2 次)，裂解液 12000 ×g 离心 10min 后采集上清液，按照试剂盒说明书，进行组织样本的 DNA 提取，通过 dsDNA 高灵敏度/宽范围试剂盒检测 DNA 浓度。

2. DNA 文库搭建

基因组 DNA 经 Covaris M220 打断至 180–220bp。全外显子组测序文库构建：来源于福尔马林固定石蜡包埋组织的样本，投入 90ng DNA，其他样本则投入100ng gDNA。采用 KAPA HyperPrep 试剂盒，并遵循 SeqCap EZ HyperCap v2.3 操作指南进行制备。杂交捕获使用 SeqCap EZ Human Exome v3.0 探针，每次最多可将 11 个 gDNA 样本混合 (即多重扩增)，混合时每个文库各取 100–200ng，使总质量达到 1000–1100ng，随后在 47°C 条件下孵育杂交 16–20 小时。 47°C 条件下孵育 16–20h。捕获前后文库分别用 dsDNA High Sensitivity Assay 定量及 High Sensitivity DNA Kit 评估文库质量。处理好的样本在 Illumina NovaSeq 6000 平台进行双端 150bp 测序。

3. DNA 测序分析

测序数据用于基因组分析、等位基因特异性拷贝数数据分析、等位基因特异性倍性 (asP)、基因组突变负荷 (GB)、有害单核苷酸变异 (SNVs) 及其富集分析，验证患者来源的类器官 (PDOs) 与亲本肿瘤 (PT) 之间的基因关系。

图 3. PDOs 保留了 PT 的关键基因组特征^[3]。

a：比较非肌层浸润性膀胱癌 (NMIBC 左) 和肌层浸润性膀胱癌 (MIBC 右) 样本中，PT 与 PDOs的肿瘤纯度，通过双侧 Wilcoxon 检验，p 值=0.31 (n=15，mean±SE)，表明 PDOs 有效保留肿瘤细胞组成；b：在随机配对的样本中与真实匹配的 PDO-PT 中，比较其等位基因特异性拷贝数相似性 (随机匹配 n=312，PDO-PT n=13)，双侧 Wilcoxon 检验，p 值=4.2e-09，证实真实匹配的拷贝数图谱高度保守；c：PDOs 与 PT 间共享及特有的有害 SNVs 比例，双侧卡方检验，p 值＜0.05，提示 PDOs 在保留核心突变的同时存在异质性；d：两个代表性样本中，经肿瘤含量与倍性校正后共享及特有 SNVs 等位基因频率 (AF) 在 PDOs 和 PT 中的分布情况。(左：NMIBC BLca112：共享 SNVs 肿瘤 266个，PDOs 263 个，特有SNVs 肿瘤 141 个，PDOs 296 个；右侧为 MIBC Blca86：共享 SNVs 肿瘤 201 个，PDOs 209 个，特有 SNVs 肿瘤 281个，PDOs 1436 个)，双侧 Wilcoxon 检验，p 值＜2.22e-16，表明 PDO 在保留主干突变的同时获得新的亚克隆变异；e：匹配 PDO 与 PT 中共享点突变的克隆性分析 (BLCa112 和 BLCa86)，图中标注双侧相关性检验 p 值与皮尔逊相关系数 (R)，p 值＜2.22e-16，证实主干突变的克隆组在 PDO 模型中得以保持；f：两个代表性样本 (左 NMIBC BLCa112；右 MIBC BLCa86) 的 PDOs 与 PT 间拷贝数变异谱和点突变谱比较，进一步证实 PDO 模型再现 PT 的基因组架构。

以上是类器官鉴定的四大检测方法，希望能为您的类器官研究提供参考~除了通过 HE 染色、免疫组织化学法这些类器官鉴定的常规手段，同时可根据实际需求选择免疫荧光、基因检测等其他鉴定方式，以保证后续类器官治疗敏感性检测结果的可信度。

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[1] 黄蕊，等. 类器官技术在中医药领域的应用全景:从基础机制到 临床实践的机遇与挑战。南京中医药大学学报 2025 年 7 月第 41 卷第 7 期

[2] 中华医学会消化病学分会医工交叉协作组. 中国经内镜消化系统常见恶性肿瘤组织取样及类器官培养专家共识(2024，成都)[J]. 中华消化内镜杂志, 2024, 41(5): 337-350. 

[3] Minoli M, Cantore T, Hanhart D, et al. Bladder cancer organoids as a functional system to model different disease stages and therapy response. Nat Commun. 2023 Apr 18;14(1):2214.