Cancer Cell | 肿瘤形态和功能研究揭示胰腺癌局部细胞外基质破环和神经侵袭的基础

研究利用激光显微切割（LMD）技术，从未经治疗的胰腺导管腺癌（PDAC）样本中分离出形态学可区分的区域，每个区域包含200-500个细胞（图1A）。共收集102个样本，并进行RNA测序，平均每个样本表达9,513个基因（图1B）。通过共识聚类和主成分分析（PCA），研究人员将这些肿瘤区域分为四个基因表达簇（图1C, 1D），进一步结合组织学分析，归纳为三种主要的形态功能变体（图1E）。

腺体型变体（Glandular, GL）具有典型的导管状结构，细胞形态类似胃黏液分泌细胞或胆管上皮，表现出端胚层分化特征。过渡型变体（Transitional, TR）表现出不规则的腺体边界，腺腔发育不全，并包含印戒样细胞，其特征为胞质黏液丰富，细胞核被挤压至周边。未分化型变体（Undifferentiated, UN）则由成片或巢状肿瘤细胞组成，其中既包含高度紧密排列的圆形细胞，也包括异质性明显、富含角蛋白的鳞状细胞，甚至存在异常核分裂的巨大多形性细胞。

在分子水平上，腺体型和过渡型共享多个功能模块，涉及核糖体生物合成、蛋白翻译及细胞极性维持（图1G）。但腺体型特异性表达端胚层分化相关基因GATA6、HNF1B和PDX1，而过渡型则上调TGFB2、VIM、FN1及ZEB1等EMT相关基因，提示其具备一定的间充质特征。未分化型表现出高度异质性，不仅表达干细胞相关因子TP63和DCLK1，还具有神经元谱系启动的特征，如GABA受体、SLIT-ROBO信号通路分子，显示其高度可塑的特性。研究进一步通过空间转录组学及RNA原位杂交验证了这些变体的存在。这一发现为PDAC的组织学分类提供了新的分子依据，揭示了不同形态变体在肿瘤微环境中的潜在作用，并可能影响未来的精准治疗策略。

研究采用随机森林（RF）分类器结合递归特征消除（RFE）方法，筛选出457个关键基因（图2A, 2B），这些基因在不同形态功能变体中差异表达（图2C）。基于这些基因的无监督聚类结果与初始基因聚类高度一致，分类模型在测试集中达到91%的准确率（图2D）。

该分类器随后应用于临床数据集（图2E），结果显示每个PDAC患者的肿瘤中均存在主要形态功能变体，同时伴随不同程度的其他变体共存，分类结果与组织学分类高度一致（图2E）。进一步分析发现，过渡型（transitional）变体占主导的肿瘤具有显著较差的预后（HR=2.15, 95% CI=1.01-4.59, p<0.05），而未分化型（undifferentiated）变体占主导的肿瘤则表现出更差的生存趋势（图2F）。

为优化预后预测，研究者采用弹性网络回归（elastic-net regression），最终筛选出23个关键基因，并据此计算患者风险评分，将其分为高、低风险组，结果显示两组患者的总生存期显著不同（图2G）。该基因组合在两个独立队列中均验证了其预后价值，并通过严格的四折交叉验证。

此外，研究发现不同形态功能变体的关键基因与已批准药物靶点相关，提示该模型可用于识别高风险患者，并指导个性化组合疗法。

由于LMD-seq可能会同时捕获非肿瘤细胞，研究进一步利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析PDAC形态功能变体的特征。首先，在单核RNA测序数据中，腺体型（glandular）显著富集经典型（classical-like） 特征，而过渡型（transitional）则富集间充质（mesenchymal） 特征，其中包含多种细胞外基质（ECM）蛋白相关基因（图3A, 3B）。此外，腺体型和过渡型均表现出基底样（basaloid） 特征，主要因其高核糖体基因表达，而腺体型同时富集鳞状（squamoid） 特征，但这种富集主要由MUC5AC和MUC5B等端胚层基因驱动（图3B）。

值得注意的是，未分化型（undifferentiated） 变体与神经样（neural-like） 和神经内分泌（neuroendocrine） 特征高度重叠，这一特征在接受新辅助治疗的患者中被观察到（图3B）。进一步的scRNA-seq分析验证了形态功能变体特异性基因在不同患者肿瘤细胞中的富集模式（图3C），并确认未分化型细胞比例明显低于腺体型和过渡型（图3D）。部分肿瘤细胞无法归类到任何已知变体，可能是因技术限制导致的低信号表达。

研究进一步利用CytoTRACE评估不同变体的分化状态，发现腺体型和未分化型分别处于最高和最低的分化程度，而过渡型处于中间水平（图3E, 3F）。未分化型细胞表现出类似前体细胞（progenitor-like）的特性，可能处于神经谱系启动状态，但仍保留分化为其他类型（如鳞状上皮化生）的能力（图3G）。

PDAC形态功能变体可能由肿瘤微环境信号或基因克隆选择驱动。研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）推测拷贝数变异（CNV），发现尽管患者间存在高度异质性，CNV模式更倾向于按患者聚类，而非按形态功能变体（图4A, 4B）。然而，未分化型（undifferentiated）变体的CNV数量略高于其他变体，尽管差异幅度较小（图4C）。

进一步研究基于基因表达数据，对激光微切割（LMD）分离的不同形态功能变体区域进行突变分析，采用涵盖467个基因的自定义扩增子测序面板（图4D）。结果显示，无论是PDAC关键驱动基因还是全基因组范围，三种形态功能变体间均无显著突变差异，表明其形成可能主要受微环境调控，而非基因克隆选择。

过渡型（transitional）变体中高水平的细胞外基质（ECM）基因表达（Fig. 3B）提示其可能直接影响肿瘤微环境。研究进一步分析了形态功能变体在基底膜（BM）和间质基质两大ECM区域的差异（图5A）。基底膜由层粘连蛋白（laminins）和IV型胶原（type IV collagen）构成，并通过nidogen和perlecan等蛋白交联，维持上皮细胞的极性（图5A）。

LMD-seq数据表明，未分化型变体的BM成分几乎检测不到，而腺体型（glandular）变体BM相关基因表达较高，过渡型变体则表现出更强的BM成分表达（图5B, 5C）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）进一步证实，过渡型肿瘤细胞BM基因表达显著高于腺体型，而未分化型几乎不表达BM成分（图5D–5F）。功能分析显示，ECM相关通路在过渡型变体中显著富集（图5G）。

免疫染色结果显示，腺体型区域的BM完整且连续，而过渡型区域BM成分显著增加，但由于细胞极性丧失，层粘连蛋白大量积聚于胞质（图5H, 5I）。整体来看，过渡型和未分化型变体的BM结构受损，可能促进肿瘤向周围组织的侵袭。

研究分析了PDAC形态功能变体中的间质基质，发现过渡型（transitional）细胞表现出肌成纤维母细胞（myofibroblast-like）特性。单核RNA测序（snRNA-seq）数据显示，过渡型细胞高度表达肌成纤维母细胞标志基因，包括ACTA2（编码α-SMA），以及多种细胞外基质（ECM）蛋白（如COL1A1、COL5A1、COL6A3）和信号分子（SFRP2、INHBA、IGFBP5）（图6A, 6B）。

尽管过渡型细胞仍部分保留内胚层基因表达，但其肌成纤维母细胞特征呈现渐进性变化，从低水平共表达至完全丧失内胚层特征（图 6C, 6D）。进一步分析发现，过渡型细胞的ECM基因表达显著高于其他变体，且在胶原纤维增厚方面尤为明显（图6F, 6G）。

此外，研究利用二次谐波（SHG）成像技术，发现过渡型区域的胶原纤维显著增厚，表明其对机械应力的响应增强（图6H）。进一步实验表明，在12 kPa刚度基质培养的PDAC细胞可诱导机械响应基因表达，同时激活过渡型程序并促进ECM和ACTA2的表达（图6I）。这些结果表明，ECM刚度感知可能触发过渡型变体的形成，并形成促纤维化的正反馈循环，加剧PDAC微环境的僵硬化和进展。

研究发现，过渡型（transitional）变体在神经外周富集，而在神经内显著减少（图7B, 7C）。神经外周厚胶原纤维的存在可能诱导过渡型程序的激活，而进入神经后，由于胶原纤维减少，该程序被下调（图7D）。相反，腺体型（glandular）变体在神经内略有增加。这表明过渡型程序可能受机械应力调控，并在神经微环境中表现出可塑性（图7E）。

研究发现，过渡型（transitional）PDAC细胞高度表达sFRP2（secreted Frizzle-related protein 2），一种Wnt信号通路拮抗剂，与不良预后密切相关（图8A）。sFRP2通常由CAF（癌相关成纤维细胞）分泌，但在PDAC中，其在上皮细胞中的表达亦与较差预后相关。

为了验证sFRP2的功能，研究者在MDA-PATC69细胞系中过表达sFRP2，并观察其对细胞外基质（ECM）成分的影响。ELISA实验显示，sFRP2显著增强ECM蛋白的沉积（图8C）。此外，无论是内源性表达sFRP2的PDAC细胞（图8D），还是接受重组sFRP2（rsFRP2）处理的细胞，均表现出更强的迁移与侵袭能力（图 8E）。这些结果表明，过渡型PDAC细胞通过sFRP2调控ECM重塑，增强自身侵袭性，这可能是PDAC进展的重要机制。

论文链接：

https://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(24)00079-5