显微课堂 | 基于激光的视神经再生研究新方法

2026-03-10 11:57:35, 徕卡显微系统徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

如何利用激光显微切割技术（LMD）对爪蟾蝌蚪的视神经进行精确一致的横切

由于哺乳动物中枢神经系统（CNS）的自我修复能力有限以及传统损伤模型的不一致性，视神经再生是神经生物学的一大挑战。相比之下，爪蟾蝌蚪的视神经在受伤后可以再生，因此是研究轴突再生的分子和细胞机制的理想模型。在本应用说明中，我们展示了如何利用激光显微切割技术（LMD）对蝌蚪的视神经进行精确、一致的横切，从而开发出适合成像、转录组分析和功能恢复研究的高重复性损伤模型。

简介

视神经是视网膜和大脑之间的联系纽带，由视网膜神经节细胞（RGC）轴突组成。这些轴突的跨度相对较大，其功能是维持视觉过程。在人类等哺乳动物中，视神经在受伤后的自我修复能力非常有限，往往会导致视力完全丧失。要改善这些患者的治疗效果，我们首先需要充分了解自然界中的物种神经再生的机制。在青蛙身上，视神经受损后会自发地完全再生并恢复视力。这为我们提供了一个理想的模型系统，以了解成功的视神经再生所涉及的基本机制，并为最终在再生能力不足的物种中使用视力保护疗法确定目标途径。

视神经人工损伤模型面临的挑战

使用解剖显微镜手动操作蝌蚪视神经需要高超的显微外科技术，而且动物体型小且易碎，这对手术操作提出了挑战。即使使用微型机械手和精细镊子，人工横切也是一种侵入性操作，很难在不同操作者之间实现标准化，而且往往会导致很高的死亡率。病灶大小和位置可能会有很大差异，从而导致实验重复的不一致性。这些技术限制影响了模型的可重复性，降低了下游分析的统计能力。因此，特别是在需要精确控制视神经损伤的空间或时间的研究中，很难得出可靠的结论。

治疗视神经损伤的新型激光显微切割法

为了开发一种新的手术模型，LMD7与Xla.Tg（tubb2b：mapt-GFP）Amaya转基因X. laevis品系一起用于可视化和进行视神经横断及随后的轴突再生。蝌蚪的发育阶段为43-46期。在这些阶段，蝌蚪是透明的，可用于实时荧光成像。简言之，蝌蚪被麻醉后，被放置在由4%琼脂糖制成的特制手术床上，手术床位于腔室载玻片内。蝌蚪的朝向是背朝上平放。使用Leica LMD7软件中的“测量”工具，在放大5倍的情况下，用349 nm紫外激光切割器在视神经从球状体出口的远端约300 μm处横切每只蝌蚪的左侧视神经。用“绘制”工具在视神经上绘制的线接受四次激光脉冲（120 µJ/脉冲），激光功率为55 mW（脉冲频率 = 2710），采用激光螺旋模式（步数 = 2，步长 = 5 μm，重复次数 = 2），以切割到适当深度并横切神经。荧光视神经显像中的缺口确认了切割。然后立即取出蝌蚪，在1X MMR培养基中复原，并用于随后的下游实验。

图 1：新型激光模型可实现精确且可重复的视神经切断。
A) 使用Xla.Tg (tubb2b: mapt-GFP) Amaya转基因X. laevis品系的LMD7实验装置。
B) 蝌蚪在麻醉后被放置在腔室载玻片内由4%琼脂糖制成的小型手术台上，使其背侧朝上并保持平坦。
C) GFP通道中术前和术后内源性标记的视神经图像。术后图像中荧光间隙表明视神经已成功切断。
D) 三只蝌蚪的代表性图像，显示该模型在精确性和可重复性方面的表现，其视神经均在距离眼睛相同的位置被切断。

结果

这种激光显微切割方法可实现高通量、可重复和微创的视神经横切，从而在损伤后短时间内实现强大的视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生。利用LMD7的精确性，可确保不同生物复制中病变位置的一致性，这对下游分析至关重要。该模型已被应用于通过纵向共焦成像研究轴突动态、绘制结构变性和再生（约14天）的时间表、研究细胞死亡和增殖、评估视觉通路恢复，以及通过RNA-seq描述早期转录组反应的特征。此外，该方案还与其他转基因蝌蚪品系兼容，如表达基因编码传感器的蝌蚪品系。例如，Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR 株系被用来观察激光损伤开始时视神经中的钙动态。

视频1：切片三天后，观察到左侧视神经损伤部位出现轴突萌芽，而对侧神经保持完好。通过徕卡共聚焦显微镜从麻醉的爪蟾蝌蚪身上获取Z叠图像，从而实现了再生动态的原位可视化。

视频2：通过Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR株观察钙动态。在激光横切期间和之后连续进行成像。激光损伤会导致钙离子迅速进入神经。视频被加速，荧光强度显示为热图。

结论

这种基于LMD激光的方法提供了所需的精确度，可产生一致的病变，同时将脱靶损伤降至最低，克服了人工技术的局限性。因此，它为研究中枢神经系统再生机制提供了一个功能强大且可重复的平台。该模型可用于未来的定向基因操作实验，从而扩展再生神经科学研究的工具包。

参考文献：

1. Moulin, C.、Dvoriantchikova, G.、Bineshfar, N. 等人. 新型视神经横断激光模型为视神经再生动力学提供了宝贵的见解。科学报告 14，27412（2024 年）。

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