Cell Metabolism | 免疫代谢协同进化定义了ccRCC中独特的微环境生态位

研究共收集156名患者的样本，其中33名患者接受了多区域采样，最终分析了268个肿瘤区域和78个相邻正常组织区域（图1A, 1B）。代谢组学分析采用了两批数据，M4组包含68名患者（18名多区域），M5组包含88名患者（15名多区域）。对于接受Nivolumab治疗的患者，肿瘤样本在治疗8周后进行分析，而接受联合治疗的患者则在平均7.5个月后进行分析。

主成分分析（PCA）显示肿瘤与正常组织在代谢层面上具有显著区分。通过FDR校正的Wilcoxon检验，研究分别在M4和M5组中鉴定出404种和507种差异代谢物（FDR调整p<0.05），这些代谢物与先前发表的数据（M1）高度重叠。然而PCA结果显示，免疫治疗对肿瘤代谢的影响较小，仅有6%的代谢物（33/602）在免疫治疗与未治疗组间表现出差异，但这些代谢物未集中在特定的代谢通路。

进一步的无监督层次聚类分析发现，大多数肿瘤区域根据患者来源进行聚类，但部分样本与其他肿瘤区域明显区分，PCA分析也显示其具有独特的代谢特征。这些异常样本的离子计数显著低于其他肿瘤样本（Wilcoxon p=5×10^⁻¹⁰）。研究假设这些低离子计数区域可能与组织坏死有关，并通过差异代谢分析鉴定出323种可区分坏死与非坏死肿瘤样本的代谢物。其中，鞘磷脂（sphingomyelins）通路的上调最为显著，该通路可降解生成促凋亡分子神经酰胺。病理学评估确认，5/5个计算机识别的异常样本为坏死组织，而76/83个非异常样本无坏死迹象（Fisher''s exact test p=2×10^⁻⁵）。因此，坏死是ccRCC代谢异质性的主要模式之一，影响跨患者的代谢特征。

基于这些发现，研究排除了坏死区域（n=19）、非透明细胞肾癌患者（n=44）及单区域样本患者（n=98），最终保留了31名ccRCC患者的123个肿瘤区域和64个正常组织区域用于进一步分析（Fig. 1A, 1B）。

研究通过计算“h-score”量化了ccRCC患者内及患者间的代谢异质性（IMH）。结果显示，IMH在不同患者间差异显著，最高的患者（NIVO10）代谢物可变动3倍，而最低的患者（NIVO4）仅1.3倍。总体而言，患者间的代谢异质性高于患者内部的异质性（图2A）。IMH与肿瘤分期（p=0.45）或核分级（p=0.31）无显著相关，仅6%（54/602）的代谢物在肿瘤和正常肾组织间表现出显著的患者内异质性（图2B）。

进一步回归分析发现，IMH与ccRCC的主要驱动突变（如VHL、PBRM1、SETD2等）无显著相关性（图2C, 2D）。但在代谢层面，23%（137/602）的代谢物显著关联IMH，其中鞘磷脂（sphingomyelins）富集最为明显（图2B）。基因集富集分析（GSEA）显示，IMH与免疫通路（如干扰素反应）负相关，而与细胞生长和增殖通路正相关（图2E）。IMH与细胞毒性T细胞（p=0.04）和Th17细胞（p=0.04）呈显著负相关（图2F）。因此，IMH定义了一类在代谢和微环境上独特但基因型变化有限的ccRCC肿瘤。

研究进一步分析IMH是否反映了整体肿瘤分子异质性，结果发现转录组异质性显著相关于IMH（p=0.02, 0.01），但基因组异质性无明显关联（p=0.83, 0.21）（图2G, 2H）。数据还显示，在进化层面，转录组和代谢组的系统发育关系更为相似，而基因组与代谢组间的相似性较低（图2J）。这表明，肿瘤的基因表达和代谢特征可随局部环境波动，并可能独立于基因组变化，提示肿瘤亚克隆不会在整个代谢组层面表现出广泛的差异性（图2I）。

研究发现，ccRCC的代谢异质性由胱氨酸（cysteine）积累、多不饱和脂肪酸（PUFAs）水平和活性氧（ROS）耐受性共同驱动（图3A, 3G）。胱氨酸的IMH水平比其他蛋白氨基酸高出两倍以上，表明其在代谢异质性中的重要性。代谢数据分析显示，在患者内部，柠檬酸（citrate）高的肿瘤区域与顺乌头酸（cis-aconitate）含量高及富马酸（fumarate）含量低显著相关（p<2×10^⁻¹⁶，图3B）。

主成分分析（PCA）揭示了代谢异质性的两个主要模式。第一主成分（PC1）区分了肿瘤与正常组织，PC1高的区域富含脂肪酸，但氨基酸水平降低（图3C）。第二主成分（PC2）区分了两类肿瘤区域，其中PC2低（PC2low）区域表现出更高的糖酵解水平，葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）、乳酸（lactate）和TCA循环代谢物（如富马酸和苹果酸）均显著升高（图3D）。此外，PC2low区域富含抗氧化物质，如还原型谷胱甘肽（p=0.03）、α-生育酚（p=0.006）和抗坏血酸（p=3×10^⁻⁴）（图3F）。

代谢通路分析显示，PC2low区域具有较高的PUFAs和OXPHOS活性，同时伴随ROS水平上升（p=6×10^⁻⁴）（图3F）。高胱氨酸水平与谷胱甘肽合成前体谷氨酸（p=4×10⁻¹⁶）和甘氨酸（p<2×10^⁻¹⁶）水平显著相关（图3H）。研究进一步通过GPX4免疫组化染色验证，胱氨酸富集区域GPX4表达上调（p=0.05），表明其可能通过抗氧化机制抵抗铁死亡（图3I, 3J）。总的来说，PC2low区域表现出更高的铁死亡易感性，但通过抗氧化代谢途径进行代偿调节。

研究发现，在PC2高（PC2high）区域，T细胞和巨噬细胞显著富集，表明肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞可能影响整体肿瘤代谢。基于这一发现，研究假设代谢组和免疫微环境可能共同进化，形成特定的代谢物分布和免疫细胞组合。使用RNA免疫浸润评分（immune score）分析表明，在602种代谢物中，33种（5%）与免疫评分显著相关（FDR调整p<0.05）（图4B）。其中，谷胱甘肽和胱氨酸在PC2high与PC2low区域间差异明显（图3C），此外，NAD^⁺代谢相关的代谢物（烟酰胺、喹啉酸、1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺）也表现出显著关联（图4C）。进一步分析表明，免疫评分高的肿瘤区域其喹啉酸（p=0.02）和烟酰胺（p=0.03）水平较高（图4D）。此外，这种代谢-免疫互作关系在ccRCC的多模式单区域研究中也得到验证（p=1×10^⁻⁵）。研究表明，免疫浸润可显著影响肿瘤代谢特征，尤其是在NAD^⁺代谢相关通路中。

研究表明，ccRCC肿瘤微环境（TME）的RNA特征，如血管生成基因表达和髓样细胞/T效应细胞丰度，与免疫治疗和抗VEGF治疗的疗效相关（图5A, 5B）。通过免疫荧光染色验证，血管生成和髓样细胞相关基因的表达水平分别与CD31（rho=0.63, p=3×10^⁻⁴）和CD68（rho=0.58, p=0.001）显著相关（图5C）。

混合效应模型分析发现，不同免疫特征的代谢相关性存在差异。JAVELIN特征未发现相关代谢物（图5D），而血管生成特征与4种代谢物显著相关（图5E）。髓样细胞特征与47/602（8%）代谢物相关，主要集中在N-乙酰化氨基酸（NAAs）通路，包括N-乙酰精氨酸、N-乙酰天冬氨酸等（图5F）。此外，免疫调节代谢物犬尿氨酸（kynurenine）与髓样细胞特征呈显著负相关（p=5×10^⁻³），表明髓样细胞浸润影响特定代谢物的丰度。

进一步分析发现，树突细胞和巨噬细胞分别与12%（71/602）和13%（80/602）代谢物显著相关（图5G, 5H）。单细胞RNA数据分析显示，N-乙酰转移酶基因NAT8主要在肿瘤和肾上皮细胞中高表达，而非髓样细胞（图5J），表明NAAs的变化可能由肿瘤细胞调控，而非免疫细胞直接驱动。

研究假设特定代谢组特征可能与ccRCC患者对抗血管生成或免疫检查点抑制剂治疗的反应相关。然而，由于代谢组数据的稀缺性，传统方法难以确定相关生物标志物。研究团队采用MIRTH（Metabolite Imputation via Rank-Transformation and Harmonization）机器学习算法，通过RNA数据推测代谢物水平，以填补代谢数据空白。

MIRTH首先在内部ccRCC样本（M1、M4、M5数据集）及TCGA数据库上进行验证。结果显示，该算法能准确推测肿瘤与正常组织的代谢差异（Spearman''s rho=0.85, p=1.6×10^⁻³¹），以及不同分期肿瘤的代谢特征（图6A）。在900种癌细胞系数据集中，MIRTH正确推测96%的代谢物（FDR调整p<0.05, Spearman''s rho>0.3）（图6B, 6C）。

随后，研究应用MIRTH预测7项ccRCC临床试验的代谢物水平，并分析其与无进展生存期（PFS）的关系。结果发现，7种代谢物在舒尼替尼治疗组中与PFS显著相关（FDR调整p<0.05）（图6D）。其中，saccharopine和N-palmitoyl-sphingadienine与髓样细胞特征显著相关（图5F）。此外，1-甲基咪唑乙酸（1-methylimidazoleacetate）水平高的患者对舒尼替尼反应最佳（图6E）。研究表明，局部炎症可能影响对舒尼替尼的治疗反应，MIRTH可有效识别隐藏的代谢生物标志物。