02_扩展质谱分析的极限 ——使用常规 GC/MSD 搞定法医中的未知物鉴定

2026-01-19 17:15:27, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

单四极杆气相色谱 / 质谱联用仪（GC/MS）凭借可靠性强、成本低、操作简便、适用化合物种类广、灵敏度高且具备便携性等优势，已成为法医化学等多个领域的主力分析仪器。

该仪器能满足常规分析需求，可对已知属于某一质谱库（如 NIST 质谱库）的化合物进行有效检测，但受限于标称单位质量分辨率及缺乏串联质谱功能，通常无法用于需测定元素组成的未知或新型化合物鉴定。

而元素组成测定功能以往仅存在于高分辨率质谱系统中，这类系统购置成本高、仪器体积大。不过在Cerono Bisosciense公司MassWorks软件的帮助下，单位质量分辨率下通过峰形的新型质谱校准方法，也能实现较高的质量准确度。

借助 GC/MS 系统内置的调谐化合物 PFTBA 及电子轰击电离源（EI），结合高谱图准确度与中等质量准确度，无需串联质谱，单次实验即可获取充足结构信息，在常规 GC/MS 系统上实现未知化合物分子式测定。

下文将展示如何利用安捷伦 GC/MSD系统，结合MassWorks软件的高谱图准确度与足够的质量准确度，实现法医化学中盲样元素组成的准确测定。

GC/MS上最直接搞定法医鉴定中的未知物分子式分析

1. 实验部分

样品信息：校准标准品为质谱检测器（MSD）内置的调谐化合物全氟三丁胺（PFTBA）；制备的样品中含有一个保留时间（RT）为 8.7 分钟的未知峰。

质谱条件：PFTBA 和标准品均以Profile轮廓图模式采集数据，质量范围为 40-550 m/z，离子阈值设为 0。离子源温度 230℃，四极杆温度150℃。

未知物GC分离与 PFTBA 校准：GC运行时间为 12 分钟，未知化合物在 8.7min钟时洗脱。程序设定电子轰击电离（EI）校准阀在 12 分钟时开启，13.5 分钟时关闭。

2. 数据采集与分析

图 1 展示了总离子流图（TIC，上图）以及总离子流图中标记的保留时间窗口内的平均 PFTBA 质谱图（下图）。

图1: 样品及PFTBA的TIC图（顶部）以平均 PFTBA 校准谱（底部）

利用 Cerno Bioscience 公司的 MassWorks™软件，对该时间窗口内的 PFTBA 质谱扫描数据进行平均处理，并选取所有丰度足够且能覆盖目标质量范围（40-550 Da）的 PFTBA（碎片）离子，即可建立全面的质谱校准曲线。图 2 展示了数据处理的总体流程。MassWorks 独特的校准功能可同时校准质量（m/z）和质谱峰形函数，这是实现高质量准确度（更重要的是高光谱准确度）的关键。随后，将该校准曲线应用于同一运行中前期气相色谱部分的每一次扫描，将每个原始质谱图转换为校准后的质谱图 —— 校准后的质谱图具有数学定义的对称峰形，且峰位对应准确的质量值。

图2：MassWorks 质谱校准及元素组成测定过程的大致流程

之后，通过峰检测可可靠、准确地计算出分子离子及其碎片离子的单同位素质量位置，并据此生成（通常较长的）候选分子式列表。基于光谱准确度对该列表进行排序，将最可能的分子式排在首位。光谱准确度是指给定候选分子式对应的校准质谱图与理论计算质谱图（均为向量形式）之间的一致性度量。这种基于光谱准确度的优化过程被称为校准峰形同位素图谱检索（CLIPS）。

3. 结果

选取包括 PFTBA 分子离子在内的 10 种离子进行全面的 MassWorks 校准，其元素组成和理论计算的精确质量已作为 MassWorks 校准报告的一部分列于图 3 中。采用扫描次数 1372-1446（对应保留时间 12.08-12.51 分钟）的平均数据建立校准曲线，该曲线可将原始质谱图转换为完全校准的质谱图。图 3 中叠加展示了其中一种校准离子（C₅F₁₀N⁺，质荷比为 263.9871）的原始质谱图（黑色）和校准后质谱图（红色）。一旦质谱扫描数据经过完全校准并获得已知峰形，即使在单位质量分辨率下，也能准确测定质谱峰的质量。

图3：PFTBA碎片离子 C5F10N+（精确质量为 63.9871 Da）的原始（黑色）和校准（红色）质谱图

图 3（下图）显示，谱图准确度优于 99.0% 表明所有校准离子的信号误差比优于 100:1，即不存在显著的信号饱和或严重污染，且所有校准离子的信噪比均高于 100:1。

对于在 8.7 分钟洗脱的未知峰，应用上述校准后得到的平均质谱图如图 4 所示（图中展示了该未知峰的两个主要离子 / 碎片离子）。由于无法确定这两种离子是否为分子离子，因此采用了适用于偶数和奇数电子的通用 CLIPS 分子式鉴定参数（图 5）。对 240 Da 的离子进行 CLIPS 分子式测定，共得到 147 种可能的分子式，其中 C₄H₈N₄O₄S₂⁺的谱图准确度为 98.7%，位列候选分子式首位。该离子的分子式对应的校准质谱图与理论质谱图几乎完全匹配（图 4）。若希望获得高于 99% 的谱图准确度，以更好地区分正确候选分子式与其他候选分子式，可采用更窄的质谱扫描范围，以提高该离子的信噪比，进而提升谱图准确度。

图4：未知物中两个大离子/碎片的平均质谱（红色）在 RT（保留时间）为 8.7 分钟处的图谱，以及 C4H8N4O4S2 的理论质谱（蓝色）。

在盲测结束后，经证实 C₄H₈N₄O₄S₂确实是剧毒杀鼠剂四亚甲基二砜四胺（TETS，又称 DSTA 或四胺）的正确分子式。

图5：MassWorks CLIPS 参数设定

上述方法同样可用于碎片离子的鉴定和结构解析。例如，采用图 5 所示的相同 CLIPS 参数对四亚甲基二砜四胺的 211 Da 碎片离子进行鉴定，共得到 102 种可能的分子式，其中 C₃H₆N₃O₄S₂⁺的谱图准确度高达 98.8%，位列首位（图 6）。需要说明的是，尽管 C₃H₈N₄O₃S₂和 C₂H₈N₆O₂S₂分别位列候选列表的第 2 位和第 3 位，但对于含硫化合物而言，这两种分子式不太可能是有效候选 —— 因为每个硫原子通常需要结合 2 个氧原子。

图6：未知物中两个大离子/碎片的平均质谱（红色）在 RT（保留时间）为 8.7 分钟处的图谱，以及 C3H6N3O4S2 的理论质谱（蓝色）。

4. 结论

本应用实例表明，通过涉及质量和峰形的全面质谱校准，GC/MSD 系统能够实现分子式测定。利用内置的 PFTBA 调谐标准品，在同一次 GC/MS 数据采集过程中通过注入法即可方便地建立 MassWorks 校准曲线。尽管该系统所能达到的质量准确度可能无法满足所有质荷比离子的行业标准（5 ppm），但将质量准确度与谱图准确度相结合，确实能够在实际色谱时间尺度内完成分子式测定。

这种分子式鉴定功能不仅可应用于传统质谱库NIST检索中未收录的未知化合物鉴定，还可通过对分子离子或其碎片离子进行分子式测定，作为质谱库检索结果的独立验证手段。

关于MassWorks 软件

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。