“阴阳难辨？”----qPCR结果判读技巧分享

低浓度样本由于体系中模板含量少，往往会出现在循环后期荧光信号才开始抬升的现象，表现出“弱阳性”。

以下是一个低浓度DNA样本检测结果，从扩增图谱和多组分图谱（图1A-B）可以看出，该样本在qPCR反应的后期才出现荧光信号的抬升，Ct值在36左右。如何才能判定这种信号抬升是否是靶标基因的扩增呢？我们可以结合熔解曲线（图1C）进行分析。首先熔解曲线显示单峰，其次该峰和阳性对照峰的位置一致，同时结合无模板对照（NTC）的熔解曲线无峰，可以推断出这是由于模板浓度较低导致的靶标基因的“弱阳性”扩增。

非特异性扩增指的是引物与非靶标序列结合、产生非目的片段的过程。

在下面的案例中，待测样本在扩增后期出现信号抬升，Ct值在35左右（图2A-B）。由于待测样本的熔解曲线主峰与阴性对照（该阴性对照指的是不含目的基因或者靶标序列的阴性样本对照，与无模板对照（NTC）有所不同）的主峰位置相同、与阳性对照的主峰位置不同（图2C），表明该产物并非靶基因的扩增产物。再结合NTC的熔解曲线无峰，推测该待测样本在扩增后期出现的信号抬升是由于引物结合了非靶标序列产生的非特异性扩增。如果出现这种现象，可以尝试优化反应体系或重新设计、合成引物。

在qPCR实验中，经常会出现污染的情况。污染可能来源于样本间的交叉污染、实验室设备的污染（如核酸提取仪、实验台面、超净台等）、试剂组分的污染、前次PCR扩增产物的污染等。

在下面的案例中，待测样本和NTC的Ct值在35左右（图3A-B），二者的熔解曲线有多峰且峰型相似（图3C），表明该反应孔的信号抬升并非靶标基因的扩增，而可能是污染引起的“假阳性”。此时需要逐一排查污染来源，针对不同的污染源采取相应的防控措施，具体详情可以参考赛默飞官网关于污染排查及防控措施的介绍：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/good-laboratory-practice-avoid-contamination-qpcr-experiments.html。

在多重qPCR实验中，为保证检测的特异性，加入体系的多组引物和探针既不能互相结合，也不能与模板上的非靶标序列结合。但在实际操作中，即使反应体系满足了上述特异性的要求，有时候仍会出现阴性样本“有扩增”、“有Ct值”的情况，表现出“假阳性”。

例如，图4展示的是阴性样本双重实验的检测结果，其中FAM 通道检测靶标基因，VIC通道检测内标基因。当内标基因的探针终浓度为400nM时，FAM信号会在循环后期出现轻微抬升，当扩增曲线与阈值线有交点时，便会得到Ct值（图4A-B）。这是体系中内标基因的探针添加量过高导致的，将内标基因的探针终浓度降低至300nM或200nM能明显改善这种现象（图4C-D、E-F）。

在qPCR实验中，编辑反应板时要按照反应孔的真实情况进行设置。比如，一个双重荧光实验，应该在反应孔中设置两个Target，如果只设置一个Target，可能会导致扩增信号异常抬升的情况，表现出“假阳性”。

图5展示的就是由于软件设置不合理导致的扩增曲线异常的案例。这是一个FAM和VIC双重反应体系，其中FAM通道检测靶标基因，VIC通道检测内标基因。如果在布板的时候，错误地只设置FAM通道来检测靶标基因而未设置VIC通道，由于VIC通道的内标基因正常扩增，此时软件会通过多组分算法强行将VIC通道采集到的荧光信号分给FAM通道，导致该待测样本表现出类似“扩增”的现象，Ct值22左右，被判读为“阳性”（图5A-B）。若将反应孔信息按照真实情况进行修改，即设置为同时检测FAM和VIC的双重体系，则该待测样本靶标基因的扩增曲线没有信号抬升，被判读为“阴性”（图5C-D）。

图5 软件设置错误导致的异常结果及正确

设置后的正常结果

A-B：软件设置错误导致待测样本有FAM信号的抬升；

C-D：正确设置后待测样本不再有FAM信号的抬升。

基线设置不合理导致“假阳性”结果

在qPCR实验中，合理划定基线和阈值线是保证实验结果准确的基础。通常情况下，仪器的分析软件会自动计算出合理的基线范围并划定阈值线，给出Ct值，用于评估样本初始核酸模板量的多少。但实验过程中受样本质量、操作、试剂或耗材等因素的影响，可能会出现基线和阈值线自动划定不合理等现象。在这种情况下，如果仍然采用软件自动划定的基线和阈值线，可能会导致扩增曲线形态异常，给出错误的Ct值，产生“假阳性”结果。

在下面的案例中，待测样本的扩增曲线表现出信号抬升的现象（图6A），软件给出一个Ct值，乍一看像是有扩增，但是仔细分析后发现：在多组分图中，该样本并没有真正的信号抬升（图6B）。之所以扩增曲线出现这种异常现象，是因为在基线期荧光信号有波动，软件自动划定的基线期（3~7个循环）不合理，此时可以通过手动调节基线期来解决，如图6C，避开荧光信号有波动的区域，则扩增曲线恢复正常。

图6 基线设置不合理导致的异常图谱及更改

设置后的正常图谱

A：基线设置不合理导致的异常扩增曲线图；

B：多组分图谱；

C：更改设置后的正常扩增曲线图。