西湖大学唐鸿云专访 | 窥见生命之不易：线粒体囊的发现

有研究表明，损伤的线粒体可通过细胞器被排出到细胞外，但是健康的线粒体是否会被排出还暂未得到验证，这也是我一直在思考和关注的问题。

恰巧我们实验室在做生殖腺相关的研究，我和我当时的博士生刘鹏选择了线虫这一模式生物，研究其减数分裂过程中线粒体的状态。为了确认精原细胞分裂中的细胞器是有选择性的分裂还是平均分配的问题，通过蔡司场发射扫描电镜GeminiSEM 300（查看更多）与体电镜技术相结合（以下简称搭载体电镜技术的蔡司Gemini300），我们从纳米级别的三维角度观察到这些特殊的囊泡，随后我们马上进行深入的研究，就催生了这个课题。

▲利用搭载体电镜技术的蔡司Gemini300对线粒体囊和精细胞高分辨率三维重构，发现精细胞通过芽吐生成“线粒体囊”将线粒体排出至胞外空间。细胞质膜先是向外形成芽突，包裹一个健康的线粒体，然后迅速芽吐生成“线粒体囊”。就像大泡泡鼓起了一个犄角，然后往外一吐，吐出一个小泡泡。

从生物电镜发展趋势上看，一类是体电镜，另一类是Cryo-ET。为了证明线粒体囊只包含一种细胞器，只切一层就说明有特异性并不客观（切的角度也会影响这种形态的判断），体电镜就作为这种膜性细胞器检测的金标准非常重要，利用蔡司体电镜技术，我们总共分析了300多个囊泡，每一个只包含一种线粒体，首次在精子里面，直接把细胞里面的线粒体绝对数量、体积、形态，完整重构出来。

用电镜证明线粒体囊的纯度很难，因为分离的线粒体囊本身又小又少，随机切很容易丢失。而电镜制样涉及到很多化学固定和重金属染色，所有的膜结构都被染成黑色，这时肉眼或者光镜是无法找到目标样品在哪儿，这一步就成了当时电镜采图的限速步骤。刘鹏博士引入了蔡司X射线显微镜Xradia 520（查看更多）之后，可以精确的定位到目标样品的位置，效率大幅度提升。

▲蔡司X射线显微镜Xradia 520和搭载体电镜技术的蔡司Gemini300联用，X射线显微镜精确定位大幅度提升了电镜制样的效率。利用Gemini 300进行高分辨率高衬度成 三维重构精细胞结构和线粒体囊的分泌，定量细胞内线粒体的绝对数量。

▲通过搭载体电镜技术的蔡司Gemini300定量细胞内线粒体的绝对数量，结果显示平均每个成熟精子中含有57个线粒体，而精细胞中约含有90个线粒体，平均减少了33个线粒体。这些数据证明此前的设想，线虫精子发育过程中，其线粒体数量确实受到严格调控，维持在一个合适范围内。

根据不同应用场景，充分利用好每个成像设备的独特优势。比如，当样品固定在树脂块中，我们需要体电镜技术看超微结构；而在活细胞中看动态变化，则需要依赖先进的光学显微镜。此次实验恰巧对空间分辨率要求不那么苛刻，分泌囊泡的时间又相对较快，所以从时间、空间等多个维度去尝试捕捉它出去的过程。尤其我们这个是原代细胞，光毒性也比较敏感，所以综合下来蔡司晶格层光显微成像系统Lattice Lightsheet 7更契合应用场景，最终也是用它在三维捕捉到了线粒体囊从精细胞出去的过程。

▲精细胞分泌线粒体囊的过程，通常在10秒内完成，且受到光毒性的影响较大。利用蔡司晶格层光显微成像系统Lattice Lightsheet 7 捕捉到了这个美妙的过程。Lattice Lightsheet 7亚细胞器分辨率，快速的三维成像和几乎无光毒性的成像特点，同时对线粒体和膜结构进行成像，捕捉到这个囊吐的瞬间。