【First-in-class药设系列】大麻素受体偏向性激动剂的设计与发现

慢性疼痛（Chronic pain）影响着超过10%的美国人口，并导致大量残疾。目前用于治疗慢性疼痛的非阿片类药物疗效较差，而阿片类药物容易被滥用，过量服用会致命。因此亟需开发更安全、更有效的慢性疼痛治疗方法。大麻素受体1型（cannabinoid receptor type 1, CB1）是一种特别受关注的非阿片类药物靶点，因为它在整个疼痛神经轴中表达。在一些动物疼痛模型中，CB1 激动剂被证实具有镇痛作用。最近科学家已经发现了几种有效靶向 CB1 受体的合成大麻素受体激动剂 (synthetic cannabinoid receptor agonists, SCRA) 。使用SCRA 治疗慢性疼痛有两个主要障碍：中枢神经系统（central nervous system, CNS）的副作用和耐药性。激活中枢神经系统中的CB1 受体会导致不良副作用，包括人类的精神活性反应以及啮齿动物的僵直症和体温过低，为了解决这些问题，已经开发出作用于中枢神经以外的外周选择性CB1激动剂。

然后这些分子在功能相关剂量下仍然会在一定程度激活中枢 CB1，因此需要大幅增强外周选择性。第二个关键障碍是耐药性，它限制了SCRAs或者外周CB1 激动剂的长期有效性。已有研究表明，这种耐药性可能是通过受体与β-arrestin的相互作用介导的。然而，大多数 SCRAs 强烈刺激 β-arrestin 通路。因此，来自美国华盛顿大学的研究团队通过合理设计新一代CB1激动剂，可最大限度地减少β-arrestin-2信号传导，不仅具有良好的镇痛效果，同时最大限度地减少副作用和耐药性。

为了开发一个外周限制性的并且arrestin信号尽可能小的激动剂，研究人员准备设计一个靶向CB1中D2.50位点的官能团带电荷的配体。这是因为作者推断增加配体电荷会降低CNS渗透性，而D2.50位点是许多GPCR的钠离子结合位点，且之前作者团队研究表明，靶向GPCR核心内的这个位点会抑制arrestin。然而，在CB1的所有可用结构中，大分子芳香族残基F2003.36和W3566.48挡住了从正交结合口袋进入D2.50的通道。目前也没有报道CB1中与D2.50相邻的 Na+结合位点。

他们对CB1与FUB（一种实验证明高效的但是具有副作用SCRA) 结合进行了分子动力学模拟。模拟显示了一个隐式口袋会暂时打开，占模拟时间的8%。这时配体可能会进入隐蔽口袋并形成有利的相互作用，从而进一步稳定其开放构象。接下来，他们从FUB开始改造，利用对接和分子建模等工具，考虑linker长度，连接点，带电官能团头部，设计了一系列可能延伸到这个隐式位点配体，最后确定在FUB的基础上加入了一个带正电荷的胍基，这样不仅可以与带负电荷的D2.50相互间作用，它的高pKa可确保在生理pH下处于带电状态，预测会降低 CNS 渗透性。计算实验结果表明，VIP36是最有潜力的配体，具有最低Glide分数和距离。

研究人员进一步合成了一系列尾部带有胍基的FUB类似物来验证他们的结构模型。然后他们验证这些配体的药理学功能。首先评估连接点位置的影响，使用cAMP测定法在CB1转染的HEK293T细胞系中表征了linker长度为4，但连接点不同的四种配体。其中VIP36的EC50最低，Emax最高，说明对G蛋白信号传导的功效最高。这是因为FUB上的这个连接点指向隐式口袋。然后评估linker长度的影响，使用了cAMP和基于BRET的β-arrestin-2募集的测定法分别评估与CB1作用强度和对β-arrestin-2募集强度。

结果表明，相较于原来的FUB，VIP36与CB1的作用强度相当，但是对β-arrestin-2募集减小了近4倍。体外 GTPase 测定进一步证明，对于CB1偶联的G蛋白Gi1，VIP36较FUB的激活作用也更强，而且这种对Gi蛋白的激活作用对1型和3型具有偏向性。此外VIP36几乎没有检测到对β-arrestin-1的募集。放射性配体竞争结合分析结果表明VIP36与FUB较CB1的亲和力也是相当的。综上，VIP36具有最佳结构，可以与隐式口袋结合，且具有较其它激动剂更低的arrestin的效能。

接下来研究人员阐明了VIP36的G蛋白偏向的分子机制。首先他们通过改变配体头部基团，发现改变电荷或极性会显著影响arrestin的募集。通过将胍基替换为不带电荷的普通碳链或引入苯环会导致arrestin募集增加。预计这两种基团都会通过空间效应（对于苯环，则通过与拨动开关残基的 π-π 堆积）保持隐式口袋开放，这表明仅开放口袋不足以减少arrestin的募集。替换为极性类似物，例如氰基、羟基或者羧基，对arrestin的刺激作用仍然很强烈。甚至胍基的生物电子等排体，例如方酰胺，它的arrestin的作用效力也很强，只有替换为带正电荷的胺类似物才能保持降低arrestin的效力，这表明尾部带正电荷或尾端功能团的碱性较高对于减少arrestin募集至关重要。活性差异最显著的是将胍基替换为尿素头部基团的VIP2.33，arrestin的募集水平已与 FUB 相似。

为了探究信号转导发生如此剧烈变化的原因，他们又解了VIP2.33与CB1结合的结构。对比VIP36, 它们的FUB部分重叠得较好，但VIP2.33的linker电子云密度几乎不可见，表明linker和尿素部分缺乏单一稳定构象。已有文献表明W6.48的不同构象可能是 CB1 信号偏向的一种机制，而V2.33的W6.48也较VIP36结构中缺乏明显的密度。他们进一步通过MD来探究CB1受体中局部相互作用与信号传导偏向的关系。结果表明，VIP36与D2.50的相互作用比VIP2.33更强。这与VIP36的胍基可以与D2.50进行离子相互作用，而 VIP2.33的脲基通过弱氢键作用的事实一致。VIP36和VIP2.33的FUB部分姿势相似，且都使得W6.48和F3.36打开，表明仅仅打开隐式口袋不足以解释信号传导的偏向。

    此外，VIP36和VIP2.33都导致W6.48构象相似，也就是说VIP36和 W6.48之间的可能相互作用也不是信号传导的偏向的原因。他们有了重要发现，当VIP36结合时，相邻的TM7稳定在一种构象中，而当VIP2.33结合时，TM7优先采用另一种逆时针旋转后构象。他们认为CB1的偏向信号传导也与TM7有关，并通过MD表明VIP36与D2.50和TM7直接相互作用，从而形成一个强烈影响TM7 构象的接触网络。除了TM7的差异，作者还对TM6的重要胞内区域进行了探究，该区域被证明在血管紧张素II 的1型受体中表现出显著的偏差依赖性构象变化。为此，他们在TM6的胞内端位点特异性地引入了环境敏感的荧光团单溴双烷。实验显示VIP36和VIP2.33对TM6胞内区域的构象集合也不同的影响。VIP36和VIP2.33两种配体稳定了不同的胞内构象，这些构象与Gi蛋白和arrestin的相互作用方式不同。

随即研究人员进行了ADME试验，包括使用平行PAMPA)和 MDCK评估血浆和脑结合、血浆稳定性和膜通透性。VIP36在小鼠和人类中均表现出高血浆稳定性。在 PAMPA中，与已建立的对照相比，该药物表现出较差的渗透性。较差的被动扩散可能是由于高极性和高碱性胍基造成的。在模拟血脑屏障的MDCK测定中，发现 VIP36 具有与奎尼丁相似的高流出比，表明它可能是 P-糖蛋白的底物。

接下来，他们进行了药代动力学 (pharmacokinetic, PK) 测定，以测量化合物在血浆和大脑中的分布。这些测定涉及VIP36，之前报道的外周限制性大麻素激动剂CB13和FUB。血浆中检测到的VIP36浓度高于大脑中的 VIP36 浓度，未结合的脑-血浆分配系数为 0.0012，表明具有外周选择性。发现 FUB 是一种脑渗透剂，系数为 2.95，而 CB13 的系数为 0.016。鉴于已知与腹膜内途径相关的变异性，还使用静脉途径检查了 VIP36 PK，并且该药物在该测定中再次显示出高外周选择性。观察到的外周选择性与体外 MDCK 测定中观察到的高流出量一致。然而，口服途径在血浆或大脑中的 PK 中均未发现完整的药物，这与 PAMPA 测定结果一致。

接下来，研究人员尝试使用三种不同的体内疼痛模型来评估VIP36的镇痛效果：炎症疼痛的完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant, CFA）模型、神经性疼痛的保留神经损伤（spared nerve injury, SNI）模型和头痛的慢性硝酸甘油 （chronic nitroglycerin, NTG）模型。VIP36都能有效减轻疼痛。SNI 模型会导致持久的异常性疼痛，适合重复给药研究。因此作者选择该模型进行后续实验。接下来，他们评估了CB1亚型选择性和其他靶点的选择性。VIP36的抗异常性疼痛功效被外周 CB1 拮抗剂 AM6545阻断，但不能被全局 CB2 拮抗剂 AM630阻断。在 CFA 测定中也获得了类似的结果。细胞内 cAMP 和生化鸟苷三磷酸 (guanosine triphosphate, GTP) 周转测定也证实了 CB1选择性。后续研究人员对 VIP36 结合 CB1 的结构为观察到的亚型选择性提供了理论依据。 

SNI 小鼠每天两次服用 VIP36，持续 9 天。VIP36逆转了异常性疼痛，并且这种效果在整个 9 天的测试中持续存在，而 FUB 在第 3 天开始出现耐药迹象。相比之下，CB13 在重复给药后诱导了显著的耐药性，在CFA 模型中效果降低了约50% 。他们又以超治疗剂量的VIP36（3, 10, 20和30mg/kg）给药，并评估四联行为以测试中枢 CB1 受体的功能性参与。VIP36 仅在剂量超过ED50的100倍时，特别是在30 mg/kg时，才在甩尾试验中诱导僵住症、低体温和热抗伤害。在3mg/kg剂量下测试了运动变化，未观察到任何变化。

    综上，研究人员通过设计外周限制的CB1激动剂来最大限度地减少Arrestin募集。通过计算设计配体来占据通过MD模拟确定的通向D2.50隐秘口袋。然后使用结构测定、药理学分析和MD模拟来验证结合模式，并确定抑制Arrestin募集的分子机制。先导配体VIP36受到高度外周限制，在三种小鼠疼痛模型中表现出显著的疗效。这对慢性疼痛治疗具有重大意义，但也可能彻底改变针对其他 G 蛋白偶联受体的药物设计。

参考文献

Rangari, V.A., O’Brien, E.S., Powers, A.S. et al. A cryptic pocket in CB1 drives peripheral and functional selectivity. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-08618-7