解决完整mRNA分析挑战的3种技术对比

2025-03-12 10:27:12, 沃特世沃特世科技（上海）有限公司

随着mRNA技术在生物医药领域的快速发展，对完整mRNA质量的深入分析变得愈发关键。在生产mRNA过程中，酶促体外转录及其后的加帽工艺可能产生多种反应产物，包括双链RNA、短片段RNA、Poly A尾部异质性以及降解产物等杂质。因此，全面解析这些产物的质量分布对于确保mRNA的纯度和完整性至关重要。

沃特世采用了一系列先进技术和色谱分离方法，对完整mRNA的质量进行了系统分析，并对比了这些技术的效果。

离子对反相色谱结合飞行时间质谱（IP-RP-TOF-MS）：该技术通过液相色谱有效分离mRNA，随后利用飞行时间质谱精确测定其分子量。IP-RP-TOF-MS不仅提供高精度的分子量数据，还能区分不同的mRNA片段，为质量分析提供了有力支持。
体积排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）：该技术利用体积排阻色谱按大小分离mRNA，并借助多角度光散射技术测定其分子量。SEC-MALS能够给出分子量的分布概况，并监测mRNA的聚集状态，为理解mRNA的结构特性提供了重要信息。
电荷检测质谱（CDMS）：作为一种新兴的质谱技术，CDMS能够直接测定完整mRNA的分子量，无需经过色谱分离步骤。其显著优势在于高灵敏度、低样品消耗量以及不受分子量范围限制，为mRNA质量分析开辟了新的途径。

图1. 三种可分析mRNA完整质量分布的仪器展示。

研究结果

在研究中，沃特世分别利用这三种技术对EPO mRNA、FLuc mRNA和Cas9 mRNA进行了分析。

EPO mRNA

如图2所示，在IP-RP-TOF-MS实验中EPO mRNA在色谱图上表现为一个约245 kDa的单峰，这与mRNA片段的质量相吻合。通过SEC-MALS分析，SEC分离的EPO mRNA主峰质量约为283 kDa，与预期一致；同时，还观测到质量为243 kDa的mRNA片段以及可能的490 kDa二聚体。此外，CDMS数据显示，EPO mRNA的主要峰值位于284.9 kDa，与预期的283 kDa非常接近，并且还观察到了一个572 kDa的峰，暗示二聚体的存在。

图2. EPO mRNA的分析结果。(1)IP-RP-Tof MS；(2)SEC-MALS；(3)CDMS。

FLuc mRNA

如图3所示，IP-RP-TOF-MS、SEC-MALS和CDMS三种技术测得FLuc mRNA的质量分别为约625 kDa、616 kDa和634 kDa，均高于预期的533 kDa。这些数据提示FLuc mRNA的实际质量可能偏高，并存在可能的降解产物。尽管结果一致，但质量误差的原因（如mRNA修饰）尚需进一步探究。

图3. FLuc mRNA的分析结果。(1)IP-RP-Tof MS；(2)SEC-MALS；(3)CDMS。

Cas9 mRNA

如图4所示，经SEC分离后，FLuc mRNA在A260波长下呈现出两个显著的吸收峰。根据MALS数据分析，这两个峰分别对应大约1490 kDa和2967 kDa的质量，这与预期的Cas 9 mRNA单体和二聚体的质量相吻合。目前尚无法确定这些二聚体是在SEC流动相处理过程中形成，还是原本就存在于样本中。通过电荷检测质谱技术获得的Cas 9 mRNA数据显示出一个1480 kDa的峰，这与SEC-MALS测得的FLuc mRNA质量接近，并且与Cas 9 mRNA预期的1493 kDa质量相符。

图4. Cas 9 mRNA的分析结果。(1)SEC-MALS；(2)CDMS。

图5. 三种能够检测完整mRNA的分析技术结果比较。

技术比较

IP-RP-TOF-MS：在应用中可能需要针对梯度条件进行优化，并且容易受到检测器饱和问题的困扰，同时在检测高质量分子时存在局限性，因为许多完整mRNA的分子量可能会超出其检测范围。
SEC-MALS：与液相色谱（LC）相关的技术相比，SEC-MALS能够提供相当精确的质量测定结果。然而，在某些特定样品处理过程中可能会遇到一些挑战。
CDMS：相较于基于液相的分析技术，CDMS的显著优势在于其所需的样品量更少，而且在进行检测时无需进行繁琐复杂的方法优化过程。

在本研究中，沃特世运用了电荷检测质谱（CDMS）、离子对反相时间飞行质谱（IP-RP-TOF-MS）以及体积排阻色谱与多角度光散射（SEC-MALS）等技术，对mRNA进行了全面的质量分析，并对比了这些技术的效果。这些先进技术的运用，不仅增进了我们对mRNA完整质量分布的认知，而且为mRNA药物和疫苗的开发提供了至关重要的数据支持。