解决方案 | 如何快速进行肠道屏障功能检测

2025-01-13 09:31:06, 安捷伦细胞分析安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

引言

肠道屏障在防止有害物质的全身性暴露中起着至关重要的作用。药物或病原体对肠上皮细胞的破坏会导致屏障功能受损，从而增加潜在有害肠道内容物的吸收。在药物开发过程中，如果能够早期识别到具有诱导通透性的药物有助于更好地确定先导化合物的优先级，并减少具有严重肠道毒性的药物进入后续开发阶段。

基于 3D 水平的肠道屏障研究

肠道是一个复杂的系统，在体外模拟肠道屏障并评估其完整性具有很大的挑战，3D 细胞培养平台例如器官芯片的出现和使用，为肠道屏障体外评估提供了更为理想的模型。目前，研究者使用器官芯片在模拟肠道屏障功能、评估药物对肠道屏障的影响和研究肠道疾病的发病机制中已经取得了一些成果。

本研究将分享安捷伦与类器官生物芯片先驱 MIMETAS 联合开发的“利用 MIMETAS OrganoPlate^® 平台和 Agilent BioTek Cytation 成像系统来评估肠道屏障功能的新方法”。

材料与方法

MIMETAS OrganoPlate^® 平台：

MIMETAS 的 OrganoPlate^® 技术，是一种用于体外器官模型的高通量 3D 细胞培养平台，使用常用的 384 孔微孔板，支持多达 96 个单独的组织模型。该平台的底部由两层光学级玻璃组成，中间由一层薄薄的微流体通道隔开，通过无泵无管式灌注系统从进样孔向组织样本输送培养基，从而简化工作流程、提高效率和重现性‌。在“肠道屏障功能检测解决方案”中，推荐使用 OrganoPlate^® 3-lane 40（MIMETAS BV, 4003 400B）—— 采用 40 个独立的肠道芯片，通过荧光染料来评估化合物对屏障功能的影响。

细胞培养：

使用人结肠腺癌细胞系 Caco-2 在器官芯片中制备肠道模型。OrganoPlate^® 3-lane 40 的每个芯片由 9 个孔（3 x 3）组成，通过三个微流体通道（宽 400 µm，高 220 µm）连接。

图 1. 在 OrganoPlate^® 3-lane 40 中构建 Caco-2 tubule 培养模型

屏障完整性检测：

在培养的第 6 天，向培养基通道 1 中加入含有荧光染料(FITC-Dextran 150 kDa，TRITC-Dextran 4.4 kDa)和凋亡诱导剂 Staurosporine(0 至 50 µM)的培养基，并立即使用 BioTek Cytation 1 细胞成像多功能微孔板检测系统对器官芯片进行成像。

Cytation 1 系统具有完善的环境控制，包括CO₂/O₂浓度控制和温度控制，将系统温度设置并维持在 37 ℃，在24小时内每小时捕获一次每个 OrganoPlate^® 芯片的荧光图像。

图 2. 使用安捷伦 BioTek Cytation 1 细胞成像多功能微孔板检测系统进行肠道屏障完整性测定

结果与讨论

Caco-2 细胞在 OrganoPlate^® 3-lane 40 中培养，并用 Staurosporine(0 至 50 µM，24 小时)处理，然后使用 Cytation 1 评估其屏障完整性。

图 3-4 数据观察到：未加细胞和 0 µM Staurosporine 条件作为对照，显示出预期的图像和接近 1 和 0 的泄漏分数。

图 3. Staurosporine 处理的 Caco-2 tubule 中 FITC - 葡聚糖（150 kDa）的渗透性

图 4. Staurosporine 处理的 Caco-2 tubule 中 TRITC-dextran（4.4 kDa）的渗透性

图 5 显示在 Staurosporine 处理的细胞中，观察到剂量和时间依赖性的屏障完整性丧失，表现为两种荧光染料从培养基向凝胶通道的渗透。通过计算泄露分数和表观渗透率（Papp），进一步量化了屏障功能的破坏程度。

图 5. 屏障完整性数据分析和表观渗透率

本文介绍了一种利用 Agilent BioTek Cytation 1 细胞成像多功能微孔板检测仪结合 MIMETAS OrganoPlate^® 平台评估 3D 肠道组织屏障完整性的方法。这两个平台共同提供了一个用户友好的界面，实现了数据收集和分析的快速高效方法。该方法为药物发现和开发过程中评估肠道屏障功能提供了一种强大的工具，有助于识别可能导致肠道屏障破坏的化合物，并加速安全有效药物的研发。

除此之外，如果想要在器官芯片上进行更高分辨率的 3D 组织结构重构，推荐使用增加了转盘共聚焦系统的 Cytation 高级型号：Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统。

图 6. Caco-2 OrganoPlate^® 的 3D 渲染。使用安捷伦 BioTek Cytation C10 共聚焦成像系统在 40 倍物镜下获取共聚焦荧光图像。以 1 µm的步进在多个 z 高度采集 3 x 3 图像拼接，跨越 150 微米的 Z 高度范围。细胞核用 Hoechst 33342 标记，细胞膜用 GFP 标记。3D 渲染使用安捷伦 BioTek Gen5 软件中的 3D 查看器工具生成。

Cytation

的独特性：

显微成像和微孔板检测的整合可同时提供细胞表型数据和定量数据，提高实验效率

集成化软件简单易用，分析模块不设限

图像采集、处理和数据分析轻松实现自动化流程

1.25 倍-100 倍物镜，结合 7 种成像模式，为用户提供更多选择

超过 20 种荧光通道选择，拼插式快捷更换，满足现在和未来应用

配置共聚焦成像和水镜可清晰观察3D细胞/类器官等较厚样本

环境控制包括温度和 CO₂/O₂ 控制与监测，无需放置培养箱

支持与自动化设备对接，实现更高通量的检测与成像分析

多种成像和检测模式可进行数据联合分析，适用于任何检测

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关于安捷伦细胞分析

安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、Novocyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。