液相色谱柱的分类及常见填料分类

2024-12-27 15:12:48 上海鲲霆生物科技有限公司

一、色谱柱基本知识

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10um等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，也要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

1.柱的构造

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70Kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2-20um(5-10um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10cm，填料粒径2～3um。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC－MS联用。

但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100ul/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因进样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

3.柱的填充

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um时，干法填充制备柱较为合适；颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法，柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。

必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

二、液相色谱柱规格

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类

①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm,柱长10~30cm；

②窄径柱（narrowbore），内径1~2mm，柱长10~20cm；

③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；

④半制备柱，内径＞5mm；

⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；

⑥生产制备柱内径可达几十厘米。

三、色谱柱了解

1）平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布

颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)

颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀

无定型：柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀，谱带扩展

2）键合相化学

1.影响化合物的分离度

2.不同键合相对不同种类的化合物分离不同

3.可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN

3）含碳量

1.含碳量越高，k‘值越大（固定相传质效应增加）

2.高含碳量有利于不易保留的化合物的分离、水解稳定性好，重现性好、有利于极性化合物的拖尾改善

3.低含碳量有利于分析中性及碱性化合物、降低溶剂损耗、填料的端基封口、封口残余硅羟基、减少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

不同色谱柱的含碳量如下所示：

4）填料的端基封口

封口残余硅羟基、减少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

5）硅胶的活性

主要影响碱性化合物的保留行为：k''，生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同，是选择性差异的主要来源，硅胶的杂质含量，重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小，是色谱柱质量好坏的重要标志，填料的稳定性，硅胶填料，pH：2-8，聚合物填料，pH：2-12，pH值小于2时，键合相水解，液相色谱法能否将某一样品完全分离，主要取决于色谱柱的选择性和柱效，这在很大程度上取决于固定相的选择是否适当。

6）色谱柱的规格：内径、检测的灵敏度、样品的容量

长度、分离度，理论塔板数、速度、样品的容量、检测的灵敏度

7）柱性能评价：购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

常见色谱柱中的填料分类

a、反相（与离子对）方法

C18（十八烷基或ODS）----------- 普适性好；保留性强，用途广

C8（辛基） -----------与C18相似，但保留值稍小

C3，C4 -----------保留值小；大多用于肽类与蛋白质

C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不稳定

苯基，苯乙基 -----------保留值适中；选择性有所不同

CN（氰基） -----------保留值适中；正相和反相均可使用

NH2（氨基） -----------保留性弱；用于烃类；欠稳定

聚苯乙烯基b -----------在1＜PH＜13的流动相中稳定；对某些分离峰形好，柱子寿命长

b、正相方法

CN（氰基） -----------普适性好；极性适中；用途广

OH（二醇基） -----------极性大于CN

NH2（氨基） -----------极性大，欠稳定

硅胶b ------------普适性好；价廉；操作欠方便；用于制备LC

c、空间排阻方法

硅胶b -----------普适性极好；作吸附剂用

硅烷化硅胶 -----------吸附性弱，溶剂兼容性好；适用于有机溶剂

OH（二醇基） ------------欠稳定；在水SEC中使用（凝胶过滤）

聚苯乙烯基b ------------广泛用于有机SEC（凝胶渗透）；一般与水和极性大的有机溶剂不相容

d、离子交换方法

键合相 ------------稳定性与重现性均不好

聚苯乙烯基b -------------柱效不高；稳定；重现性好

[ 参考来源 ]：根据健研申讯、药物分析之家等网络资料编辑整理，

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