后疫情时代，淋巴细胞亚群检测帮助判断“阳康”人群免疫恢复

自2022年12月国家实行疫情开放政策以来，新型冠状病毒在短短两个多月的时间内迅速席卷全国。“新冠后遗症”、“长新冠”等相关话题时常占据大众关注的热点。当前，中国国内流行毒株主要为奥密克戎变异株，虽然相比原始毒株及德尔塔变异株，该毒株致病力已大大减弱，但对人们的长期影响不容小觑。

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免疫系统作为机体防御病毒感染，清除感染细胞，维持机体稳态的重要系统，在新冠病毒感染整个过程中以及机体康复过程中均起到重要作用。研究表明免疫系统失调和炎症反应紊乱在新冠病毒感染发病和后遗症发生机制中扮演重要角色^[3]。

人体外周血淋巴细胞（如TBNK，包括T细胞、B细胞、NK细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞等）作为反映机体免疫状态的重要组分，是临床检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标。多篇研究证明外周血淋巴细胞的数量与新冠患者的轻重症密切相关，在重症患者中，患者T细胞、B细胞、NK细胞都全线降低，显著低于轻症患者。并且近期出台的《奥密克戎变异株所致重症新冠病毒感染临床救治专家推荐意见》明确表示：低淋巴血症与疾病严重程度及预后密切相关，淋巴细胞计数<500/μl提示预后差；当CD3⁺T细胞<200/μl，CD4⁺T细胞<100/μl，CD8⁺T细胞<100/μl，B细胞<50/μl时与高住院死亡风险相关^[4]。

新冠患者的临床康复并不意味着患者完全康复，在新冠病毒感染的康复阶段仍然存在潜在的慢性炎症及免疫力不佳。有研究表明新冠患者出院2周后，CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、B细胞数量依旧显著低于正常对照组^[5]。

图3.新冠患者恢复期TBNK亚群显著低于正常对照组[5]

而且，也有研究调查发现患者康复出院13个月后，10.3%的患者存在CD3⁺T细胞减少、4.9%患者存在CD4⁺T细胞减少，8.2%的患者存在NK细胞升高^[6]。

如果新冠感染后机体免疫力长期未恢复，处于免疫失衡状态，有可能增加再感染风险，同时，低下的免疫状态也伴随着其他微生物感染风险的增加。在一项病例研究中就发现，一例伴有冠状动脉疾病、高血压的轻型新冠老年患者在出院3个月后，在对外周血淋巴细胞亚群检测（TBNK检测）后发现，患者CD3⁺T细胞只有92个/μl , CD4⁺T细胞52个/μl, CD8⁺T细胞37/μl，远远低于正常参考值。为了防止患者感染其他微生物，医生对患者采取了阿托伐醌治疗以提前预防肺孢子虫肺炎^[7]。这一证据表明，对于老年患者，尤其是患有基础代谢病人群定时进行TBNK检测，评估机体免疫状态，根据免疫水平变化及时进行药物干预，防止潜在感染的发生。

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TBNK的恢复异常或与新冠康复患者的后遗症发生也存在密切关系。情绪波动作为新冠的一类重要后遗症，一项研究就表明，新冠康复期，患者淋巴细胞数目与焦虑和抑郁相关，CD3⁺T细胞在抑郁患者的总数显著低于非抑郁患者，NK细胞数量在焦虑和抑郁患者中也显著降低^[8]。

表1.淋巴亚群数量与患者焦虑和抑郁相关[8]

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大量的研究已经证明，外周血淋巴细胞亚群检测在新冠肺炎康复期具有重要意义，并且最新发布的《新型冠状病毒感染康复期人群健康体检特殊项目的专家共识》也明确建议^[9]：

那么如何进行淋巴亚群分析检测呢？

目前，临床上常见的TBNK检测方法是通过流式细胞术进行的。流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单个细胞进行多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流式细胞术以其快速，灵活，高通量，高灵敏度和定量的特点，广泛应用于临床、细胞生物学研究、免疫学研究、白血病淋巴瘤免疫分型、干细胞研究等领域^[10]。

碧迪医疗生物科学作为全球流式细胞技术的领导者，一直以来不断更新产品和技术，用智能高效的整体解决方案助力广大临床和科研工作者。BD FACSCanto Flow Cytometer和BD FACSLyric™ Flow Cytometer作为临床的两款主力机型，依靠其稳定的性能、高灵敏的荧光检测能力获得了临床工作者的高度肯定。

TBNK的检测原理是通过荧光标记的单克隆抗体对血液中T细胞、B细胞、NK细胞特异性的分子标志物进行染色（CD45表达于所有白细胞细胞中，CD3表达于所有T细胞中，CD4表达于辅助性T细胞，CD8表达于细胞毒性T细胞中，CD19表达于B细胞中，CD16/CD56表达于NK细胞中）。当荧光抗体与血液中的白细胞表面抗原特异性结合后，再经过红细胞裂解，即可通过流式细胞仪对细胞进行获取，不同荧光素标记的单抗在激光的激发下会发出不同波长的荧光信号，这些荧光信号以及散射光信号会被仪器探测器接收，从而提供荧光强度及细胞大小、内部复杂程度等信息，通过圈门进而分析得到T细胞、B细胞、NK细胞的相对比例或绝对计数结果。

在淋巴细胞亚群检测中，临床上常见的有相对计数法和绝对计数法。相对计数法是分析各亚群细胞占总淋巴细胞数的百分比，结果易受各类细胞亚群变化的影响；而绝对计数法通过在样本中加入绝对计数微球，通过检测细胞与绝对计数微球的比例从而计算出各类细胞亚群每微升的绝对数量，同时也可获得相对计数法的百分比值。一种淋巴细胞亚群绝对计数的变化不会影响其他细胞亚群绝对计数的变化，因此，只分析各淋巴细胞亚群的百分比不能客观、准确地反映患者的免疫状况，建议同时检测淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数^[11]。

图4. BD FACSCanto Flow Cytometer淋巴亚群检测结果

图5. BD FACSLyric™ Flow Cytometer淋巴亚群检测结果

以上两张检测结果图分别为BD FACSCanto Flow Cytometer和BD FACSLyric™ Flow Cytometer仪器检测淋巴细胞亚群的结果图。现以BD FACSCanto Flow Cytometer结果为例，对结果中的每张图进行解释：

图6.淋巴亚群检测结果注释

检测结果图下方的统计表展现了不同CD3⁺总T、CD3⁺CD4⁺Th、CD3⁺CD8⁺Ts、CD3^-CD19⁺B、CD3^-CD16⁺/56⁺NK细胞亚群占总淋巴细胞的比例，以及通过绝对计数微球换算得到每个细胞亚群每微升的绝对计数结果。

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对新冠恢复期患者进行TBNK检测，可以快速、准确的获得患者当前状态下T细胞、B细胞、NK细胞的准确数量，对于判断患者当前免疫状态具有重要价值。恢复期患者最长见到的当属T细胞、B细胞、NK细胞数量低下，此时患者免疫力较弱，应该注意休息，同时可以采取胸腺五肽等药物干预，帮助免疫细胞快速恢复。

尤其对于65岁以上老人，或有心脑血管疾病、糖尿病、慢性肺部疾病、慢性肝炎等基础疾病者、免疫功能缺陷或长期服用免疫抑制药物的患者定时进行TBNK检测，评估机体免疫状态，根据免疫水平变化及时进行药物干预，对于患者的生活质量提高至关重要。