【技术分享】浅谈液相方法的放大

2024-07-01 11:23:54, 市场部吴初艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

液相色谱方法的一个很重要应用方向就是分离、纯化目标物质，无论是天然产物还是人工合成产物，制药领域还是食品农业等领域，目标物的纯化都有着非常重要的意义。以液相色谱方法为基础的制备经历了长时间的发展和经验积累，形成了一系列设计和优化的方法和思路。

制备液相色谱和分析液相色谱传统上会以色谱柱尺寸或者流速区间进行区分，但最本质上的区别在于对分离得到的化合物的处理方式。制备液相中需要将产物分别收集以供进一步处理，而在分析液相中得到的产物通常不需要收集。通常，载样量为填料重量 0.1%–1.0%，常见的色谱柱规格及方法的对应关系如下表。

色谱柱内径

进样加载流速填料

色谱柱容积

mmmLmg

(mL/

min)

gmL

4.6

0.1

251

2.5

410

0.5

118

11.8

21.2

2.1

531

53.1

8830

4.3

1063

106.3

177

11.8

2954

118

295.5

491

填料(a)=Pd×Vol填装密度(Pd)=0.58a/mL以及Vol=p×r²×L(r和L单位为cm)

在设计放大纯化实验时，应该先进行小规模分离方法的实验，确定实验方法和分离机制。然后再确定用于放大的色谱柱尺寸、方法流速、上样量及色谱系统硬件参数要求。

常见的各参数放大计算公式如下，也可以访问Phenomenex飞诺美中文官方网站，使用制备柱及DAC方法放大计算器进行初步的换算。

（https://www.phenomenex.com.cn/Tools/preplc-scaleup）

制备柱与DAC方法放大计算器示例页面

以下是使用Venusil PrepG系列分析柱和制备柱进行方法放大的实际案例：

分析方法：

色谱柱：Venusil PrepG C18 10μm 120Å

4.6×250mm

流动相A：水

流动相B：乙腈

流速：1ml/min

波长：260nm

进样量：10µL（2mg/ml）

梯度：

Time

B%0703090

分析图谱

时间

峰面积

峰高峰宽

对称因子

峰面积%

4.765

100.4

13.3

0.128

0.95

0.632

5.111

24.7

2.3

0.171

0.88

0.156

7.79

12.3

6.9E-1

0.2718

0.973

0.077

9.321

36.4

1.6

0.3299

0.831

0.229

11.427

1441.8

0.3138

0.953

9.082

12.768

1219

54.4

0.3496

0.909

7.678

15.523

7185.7

313.1

0.3638

0.965

45.260

17.033

5816.1

240

0.3788

0.96

36.633

21.28

40.2

1.5

0.4067

0.979

0.253

放大纯化方法：

色谱柱：Venusil PrepG C18 10μm 120Å

21.2×250mm

流动相A：水

流动相B：乙腈

流速：16ml/min

波长：

260nm（红色信号线）

215nm（蓝色信号线）

进样量：100mg

梯度：

Time

B%0703090

放大纯化图谱

作为放大制备的第一阶段，mg-g级别的纯化方法是非常关键的。通常mg-g级的产物会被用于早期生物学评价及药效评价等关键实验。Agela HS-D-5800P 40Mpa制备型高压液相色谱系统，正是转为mg-g级别的制备需求设计的。Agela HS-D-5800P 40Mpa 制备型高压液相色谱系统采用双柱塞并联溶液传输单元，为色谱实验提供了更高的流量准确性和重复性。采用耐用的配件，以高稳定性增强实验人员长时间复杂样品制备及过夜制备的信心。搭配大尺寸的自动进样器和馏分收集器，进一步满足高通量的样品处理的需求。

针对复杂样品制备的多级梯度编辑一直是制备实验人员的痛点，HS-D-5800P 软件专为这一痛点进行了优化。支持通用多级梯度方法的设置和直接调用，大大节约了程序设定时间。调用通用方法后，可在运行界面进行再次编辑微调。丰富的可编辑方法字段，也可以自定义将不常用字段隐藏，界面更加简洁明了。表格区域支持一键插入、在线拖拽调整及增加梯度点的编辑功能，也可一键切换预设条件收集和手动收集，告别冗长的复杂操作。

全新升级的软件版本还支持循环 (叠加) 进样功能，支持定点 (重复) 收集功能。更适合大体积样品的多次重复进样实验，软件逻辑经行业专家验证测试，无需付出额外学习成本即可迅速上手使用。