技术问答 | 不打扰的温柔！荧光PCR如何解决串扰，各自安好？

《荧光PCR技术常见困扰专题》第四篇，了解清楚污染、交叉、抑制现象出现的原因和解决办法后，本期我们继续谈谈qPCR实验的又一个重要技术困扰：串扰现象。

在进行多通道检测的荧光PCR实验中，往往会出现某通道未加入全部的荧光PCR要素（上下游引物、探针、模板）时也会有Ct值和扩增曲线，而且这种情况与仪器绑定，无论是否更换检测项目和检测人员，此情况会一直存在。这种情况，我们称之为串扰现象。

为什么会发生串扰？

WHY THIS HAPPEN

QA

@小微

串扰现象可以理解成一个检测通道中发出的光被另一个检测通道检出。一般情况下，荧光探针都是5’端标记荧光报告基团（荧光素），3’端标记淬灭基团。荧光PCR仪检测时会发出特定波长的光，激发荧光基团。而荧光基团接受了激发光后会形成电子跃迁，然后再以较长波长的光发散出去，然后此波长的光会被仪器检测到，形成一次记录。但是电子跃迁的能级不会一致，跃迁后再发出的光波长也不一致，各能级的电子在数量上大致上呈泊松分布。常用的荧光素及其参数如下表所示。图1则显示了5种常用的荧光染料之间发射波长的交叉区域，该区域即为串扰区域。发射波长在串扰区域内的光，可以同时被两个检测通道检测到，这便是串扰来源的根本原因。

荧光染料

吸收波长

(nm)

发射峰

(nm)

检测波段

(nm)

6-FAM（6-fluorescein）

494

525

470-525

HEX(Hexachloro-Fluorescein)

535

556

523-564

ROX(6-Carboxyl-Rhodamine)

587

607

571-612

Cy5(Cyanine5)

646

667

628-692

Cy5.5(Cyanine5.5)

683

705

678-718

表1 常用荧光素的吸收波长、发射峰波长和常见的仪器检测波段数据

图1 FAM/HEX/ROX/Cy5/Cy5.5染料发射波长示意图（含串扰区）

如何解决串扰？

HOW TO RESOLVE

QA

@小微

串扰现象属于仪器和染料的固有物理属性，现阶段各荧光PCR仪厂商会在仪器的光栅部分进行改进并且加入软件算法来尽可能的消除串扰对实验结果的影响，但是这种消除效果并不稳定，极易受人员和环境的影响。所以，目前解决串扰现象的最简单的方法是选择无明显串扰区的染料作为多通道荧光PCR的荧光基团。

THE END

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