市售反相液相色谱柱进行色谱分类和比较

市售反相液相色谱柱

进行色谱分类和比较

ACD/Labs

摘要

作者共对 135款市售的色谱柱包括烷基、氰基、苯基、全氟、极性嵌入、增强极性选择性（比如：极性/亲水封端）、Aqua型和各种新型的色谱柱（包括一些非硅胶基质色谱柱）进行了表征。表征参数为：表面覆盖率、疏水选择性、形状选择性、氢键作用力和在 pH 值为 2.7 和 7.6 时的离子交换能力。

作者使用主成分分析法提供了一种简便的图形用于比较在整个数据库和不同类别（如 Aqua/增强极性选择性）色谱柱间的异同点。并使用主成分分析法将色谱柱与一系列亲水性碱性化合物的分析能力相关联。

01

介绍

不断增加的LC色谱柱填料对色谱分析研究员带来一定的挑战。其困难点在于：“对于某个确定的应用，这些色谱柱中的哪一款是最优的？制造商们没有采用标准化的测试程序，其选择的实验条件是为了显示一种色谱柱填料比另一种填料更好，因此直接比较制造商提供的数据被证明价值偏低。尽管分离科学取得了许多进步，色谱柱的选择仍然是方法开发中的薄弱环节。在太多的情况下，研究员的色谱柱的选择是基于前期哪个色谱柱效果最好，或者干脆哪个色谱柱在手边里就选用哪个。    

很多学术组织、色谱柱制造商和用户意识到这个问题，尝试通过色谱、光谱和物理方法等来表征色谱柱。许多制造商提供了以下的物理参数，如碳载量、粒径(μm)、比表面积(m2/g)、孔径(A)、孔体积(ml/g)、计算键合相覆盖率(mmol/m2)以及色谱柱是否端封。这些物理参数对于制造商的质量控制非常有用；然而，这些参数与色谱柱性能之间往往没有什么相关性。

也有人利用29Si，13C，1H NMR和FT-IR光谱等技术研究LC色谱柱的表面特性。NMR光谱技术价格昂贵，应用范围不广。此外，获得的数据非常复杂，它们与色谱观测的关系是不确定的，因此与色谱运用的相关性很小。

相比之下，色谱方法是最有意义的。可以通过指定和测量某些简单且表征良好的探针/分析物可以描述与色谱柱之间的离散物理化学相互作用。一些研究已经使用了各种分析物，也发表了文献描述实验条件。

结合不同的化学计量工具如主成分分析(PCA)、聚类分析和雷达图等分析色谱方法的结果，可以进一步进行可视化分组、表征反相色谱柱填料，并更好地了解分析物与色谱柱填料之间的基础分子相互作用。

为了使分析人员能够做出合理的选择，作者对135种具有不同化学性质的新旧色谱柱进行了独立的评估/表征，使用众所周知和公认的标准测试程序，以生成一个公正的数据库。本文这项工作扩展了作者的原始论文，其中描述了79种不同的色谱柱。扩展后的135个市售色谱柱数据库现在包含烷基、氰基、苯基、全氟化、极性嵌入、极性/亲水端封(增强极性选择性)、Aqua和各种新型色谱柱，包括一些非硅胶基质色谱柱。

这135款色谱柱构建的数据库可以用多种方式解释:本文强调了使用PCA分析的价值，从而实现:

识别等效色谱柱，避免仅依赖于某一个制造商的色谱柱，并将色谱柱分类为药典类型。

选择具有广泛不同色谱特征的色谱柱，以便在方法开发中充分利用其选择性差异。将分析物的物理化学性质与色谱柱的特征相结合，相应地对色谱柱的选择进行加权应该是可行的。

对分析物与色谱柱之间的分子相互作用有更深入的了解。

PCA是解释大型数据库的通用工具。在PCA中，将135个色谱柱原始数据投影到较小的新变量集 (PC，主成分)上，在更小维度上利用新变量进行分析(在本例中，降维六个特征参数)。第一主成分应尽可能多地保留对原始变量的解释，第二主成分以与第一主成分正交变换的方式确定，并且旨在尽可能多的保留对原始变量的解释，依次类推。

目标(色谱柱)在PC上的投影被称为主成分分数。通过绘制两个PC上的散点图，可以发现色谱柱间的异同。散点图中目标之间的距离可以体现出它们是相似还是不同。

主成分与每个原始变量之间的关联程度通过载荷来描述（每个独立变量一个值）。通过绘制两个主成分的载荷，可以看出哪个原始变量的影响最大(即：到原点的距离最远)，以及是否有变量是相关的(即：在通过原点的直线上是相同或相反的方向)。

通过贡献图，可以很容易地确定两个目标色谱柱不同的因素。这种类型的图显示了哪些变量(色谱参数)导致两个目标(色谱柱)之间的差异，或者一个色谱柱和整体色谱柱之间的差异。

此外，将PCA的结果与五种不同物理化学性质的化合物的分析相关联(见表1)，以评估在合理选择色谱柱时表征程序的范围和适用性。

02

实验

2.1化学品和试剂

所使用的溶剂均为Romil (cambridge eshire, UK)提供的HPLC级以上溶剂，除了水是由Milli-Q-plus 185超纯水系统(Molsheim, France)提供的。

苄胺、正戊苯、正丁基苯、苯并菲、邻三联苯、咖啡因、苯甲醇和硫脲均由Sigma-Aldrich(Dorset, UK)提供。苯酚、KH2PO4、H3PO4和KOH由Fisher Scientific (Leicestershire，UK)提供。

研究选择了五种与药物相关的碱性分析物，涵盖了一系列的pKa和log D值。其中包括由Sigma-Aldrich公司(Poole，UK)提供的盐酸苄胺和硫酸沙丁胺醇，由Fluka公司(Dorset, UK)提供的尼古丁(游离碱)和盐酸普鲁卡因胺，以及阿斯利康公司的复方特布他林硫酸盐 (来自阿斯利康研发Charnwood (Loughborough, UK)复方库-浓度均为0.3 mg/ml。

亲水性混合测试溶液由100 μl尼古丁、盐酸苄胺、盐酸普鲁卡因胺、硫酸特布他林、硫酸沙丁胺醇和苯酚(浓度均为0.3 mg/ml)加500μl水组成。亲水性混合测试溶液中各组分的化合物编号、结构、pKa和log D值见表1。

2.2仪器

LC分离在HP1090M series II或Agilent 1100液相色谱仪上进行，配备ChemStation v. 6.04 LC软件(安捷伦，chadle， Cheshire)，配备柱切换阀(Jones chromatography, Mid-Glamorgan, Wales或Valco international， Schenkon， Switzerland)和Mistral柱温箱(Spark Holland, Emmen, The Netherlands)

2.3液相色谱方法

所有色谱柱均为制造商/供应商提供的新柱。用于液相色谱表征的色谱条件如前所述，现总结如下：甲醇进样时基线的第一个波动记为死时间。

表征6个反映不同色谱性质的变量。进样量和流速已经基于150mm*4.6mm色谱柱进行了转换。下面对每个变量进行简要描述:

戊基苯的保留因子，kPB：反映表面积和表面覆盖率(配体密度)。色谱条件：MeOH-H2O  (8:2， v/v)， 1.0 ml/min， 40℃， 进样体积5μl (戊苯0.6 μg/ml)。

疏水选择性，aCH2：戊苯和丁基苯之间的保留因子比，aCH2=kPB/kBB。这是对色谱柱表面覆盖率的度量，一个甲基差异的烷基苯之间的选择性取决于配体密度。色谱条件：MeOH-H2O (8:2， v/v)， 1.0 ml/min， 40℃， 进样体积5μl (戊苯0.6 μg/ml和丁苯0.3 μg/ml)。

形状选择性，aT/O：苯并菲和邻三联苯之间的保留因子比，aT/O=kT/kO。这是形状选择性的度量，它受配体差异的影响，也可能受硅烷键合基团的形状/功能的影响。色谱条件：流动相同“疏水选择性”项下，进样体积5μl (苯并菲和邻三联苯各0.05 mg/ml)。

氢键能力，aC/P：咖啡因与苯酚的保留因子比，aC/P =kC/kP。这是对可及的硅羟基数量和封端程度的度量。色谱条件：MeOH-H2O (3:7， v/v)， 1.0 ml/min， 40℃，进样体积5μl (苯酚1mg /ml和咖啡因0.5 mg/ml)。

总离子交换能力，aB/P pH7.6：苄胺与苯酚的保留因子比，aB/P pH7.6=kB/kP。这是对总硅烷醇活性的度量。色谱条件：MeOH-H2O (3:7，v/v，含20mMKH2PO4，pH7.6)， 1.0 ml/min， 40℃，进样体积5μl（苯酚和苄胺，浓度均为0.5 mg/ml）。

酸性离子交换能力，aB/P pH2.7：苄胺与苯酚的保留因子比，aB/P pH 2.7=kB/k。这是衡量硅烷醇基团酸性活性的指标。色谱条件：与上述总离子交换测定的条件相同，但使用pH 2.7的KH2PO4缓冲液。

亲水性碱性化合物分析：色谱条件：MeOH- H2O (3.3:96.7， v/v， 含20mMKH2PO4，pH2.7)，1.0 ml/min， 60℃， 进样体积5μl（亲水性混合测试溶液，在210 nm处检测）。

在所有测试中，分析物通常在30min内洗脱。

2.4使用的软件

2.4.1主成分分析

采用Simca-P 8.1软件(Umetrics，Sweden)进行主成分分析。表征色谱柱的六个变量都被纳入分析。为了给予所有变量相同的权重，这些变量是“无量纲”的，即：每个变量与该变量平均值的差值，除以其标准差。

2.4.2 Log D和pKa预测

使用Advanced Chemistry Development软件程序(Toronto， Canada)用于pKa和log D的预测。

03

结果与讨论

3.1色谱柱表征参数

迄今为止，已有许多不同类型的方案被建议用于表征反相填料，这些方案利用不同的测试分析物和不同的LC条件。Tanaka表征方案是一种成熟的方法，受到学术团体和许多色谱柱制造商(如Thermo Hypersil-Keystone、默克和Phenomenex)的青睐，被用于评估色谱柱。Kele和Guiochon以及Massart及其合作者的研究小组采用了许多Tanaka试验来评估市售RP色谱柱的可重复性和再现性，并制定了色谱柱的通用药典测试方案。在Tanaka方案中测量的色谱柱的参数与色谱性质高度相关，包括表面覆盖率、疏水选择性、形状选择性、氢键能力和pH为2.7和7.6时的离子交换能力。

现将已有的色谱柱表征数据库Tanaka测试从79个扩展到135个不同的色谱柱。

表面金属活性未作为色谱柱表征参数包括在内，因为已知色谱柱的值依赖于色谱柱的使用历史。例如，色谱柱在纯有机溶剂(如ACN和MeOH)中的运输和储存以及流动相通过色谱柱的柱体积都会影响该色谱柱的金属活性，因此不同色谱柱的金属含量的可重复性和再现性很差。金属活性参数仅在该时刻对被评价的该根色谱柱有效，因此，报告这些值可能会产生误导。此外，作者之前报道过，将铁等金属“掺杂”到RP二氧化硅上不会改变本文中描述的色谱柱特征参数。

最近有几篇论文试图将Walters、Tanaka及其合作者、Galushko和Engelhardt and Jungheim的各种色谱柱表征程序联系起来。虽然各种方法的疏水性术语通常相关，但形状选择性、硅烷醇活性和离子交换能力等术语显示出较差的相关性。Claessens等人认为，不同方案的结果是不可互换的。这些测试程序不相关并不奇怪，因为每种独立的测试使用不同的LC条件和计算参数来衡量面对不同分析物时色谱柱的复杂离子/极性活性。很有可能是各种测试方案描述了不同的色谱柱参数。

3.2 PCA的完整数据库

在135种上执行的色谱柱表征程序的结果见表2。先前有报道，由于某些变量是相关的，因此仅需要六个变量中的三个(如色谱柱的色谱性质)来充分描述色谱柱的可变性。虽然这可能对C18是正确的，但作者认为这些相关性可能不适用于现在包含在扩充后数据库中的其他类型的色谱柱(如具有不同化学性质的色谱柱)，因此决定将所有六个变量包括在PCA中。

包含了135个不同的色谱柱整个数据库的PCA得分图显示了与作者2000年的论文相似的概况(结果未显示)，该论文只比较了79个不同的色谱柱。不出所料，非硅胶基质色谱柱，如氧化锆(ZiChrom PDB，色谱柱号:123)和氧化铝(Spherisorb A5Y，柱号: 90)基质色谱柱，在PCA得分图中与硅胶基质相距离较远。

完整的数据库已经包含在论文中，因为它允许工作者首先将数据作为一个整体来解释，也允许对亚类进行表征，正如Vander Heyden和Massart的小组在作者2000年的数据库上所做的那样。随后，作者对该数据的一个亚类进行了PCA分析，其中仅包含全氟色谱柱。完整的数据库包含极性嵌入色谱柱、增强极性选择性色谱柱、”Aqua型”色谱柱(包括极性封端和混合烷基配体)、氰基柱、苯基柱、全氟色谱柱、短链烷基色谱柱和非硅胶基质相，以及标准C18色谱柱(见表2)。

“聚合物”C18色谱柱，如由双官能硅烷或三官能硅烷聚合硅烷化制备的硅基C18柱，对刚性构象的化合物(如多芳烃)具有独特的形状选择性。例如，与单体C18色谱柱(典型的aT/O范围为1.3-1.8)相比，聚合物Vydac 218TP C18色谱柱aT/O=3.13，获得了极高的aT/O值。Engelhardt等人报道，Tanaka和Sander和Wise的测试在区分单体柱、中等和聚合物的能力上有很好的相关性，但不一定给出相同的形状/立体分类，Wilson等人进一步验证了这一点。聚合物C18色谱柱没有包括在本研究中，因为人们普遍认为它们的可重复性低于由单功能硅烷制备的色谱柱。最近，Kele和Guiochon的研究证实了这一点，他们强调，与单体柱相比，使用类似的测试方案，聚合物柱缺乏可重复性。对于制药行业来说，批次间的可重复性至关重要，因为所开发的方法通常要使用很长一段时间，15年或更久。在之前的LC-GC调查中，在选择色谱柱类型时，柱间可重复性被选为最重要的考虑因素。

3.3 反相硅胶基质数据库的PCA

排除非硅胶基质(柱号为6、90、95和123)和氨基色谱柱(柱号为58)，从PC1-PC2得分图中可以看出不同色谱柱类型之间的差异更大(见图1a)。A组色谱柱的特点是硅醇活性高，保留率低(见图1b中相应的PC1-PC2载荷图)，主要是非C18色谱柱和传统的C18色谱柱，如Resolve C18色谱柱(第87号柱)。相比之下，B组色谱柱为新一代C18材料，表现出低硅烷醇活性和高保留率(见图1b)。C组色谱柱含有极性封端填料，并且由于具有较高的形状选择性，这些色谱柱与其他相固定区别开来(见图1b)。聚乙二醇色谱柱(第21号柱)似乎与该子集中的其他色谱柱非常不同。

图1，(a)除非硅胶基质相和氨基色谱柱外所有色谱的PC1和PC2得分图：a，大部分为非C18色谱柱和传统的酸性(a型)C18硅胶基质相；B，多为非酸性(B型) C18硅胶基质相；C，极性包埋相。(b) 除非硅胶基质相和氨基色谱柱外所有色谱的PC1和PC2载荷图。

由于PC1-PC2评分图仅解释了61%的变量，因此构建了PC1-PC3得分图，并强调了色谱柱的进一步分化(见图2a，b)。第三个主成分对数据的变异贡献了15%。酸性色谱柱如Resolve C18，Spherisorb ODS1和Platinum EPS C18(柱号为87、91和75)可以组在一起(E组)，因为它们具有高酸性和总硅醇活性。值得注意的是，与Vander Heyden和Massart小组的研究结果相反，氢键能力与总离子交换能力无关；这在一定程度上是可以预料到的，因为扩展数据库中包含的色谱柱的多样性。

在D组(非C18色谱柱)中，可以看到大多数氰基柱(柱号为3、8、10、32、45、47、57、132)被归为一个子集H。PC1-PC3得分图还根据其形状选择性参数区分了全氟苯基柱(组号为F-柱号为14、20、26、61、71)。

高保留色谱柱如Ultracarb ODS(30)、BetaMax Neutral C18、Gromsil-Sil ODS pH7、J ''sphere ODS JH和Omnisphere C18(柱号11、36、50、68、112)具有高碳载量(＞22%)，被归类为G组，其特征是对戊苯的高保留因子和高疏水选择性。

图2，(a) 除非硅胶基质相和氨基色谱柱外所有色谱的PC1和PC3得分图：D，非C18色谱柱；E，酸性色谱柱；F，全氟苯基柱；G，高度疏水相；H，氰基柱。(b) 除非硅胶基质相和氨基色谱柱外所有色谱的PC1和PC3载荷图。

3.4硅胶基质C8和C18的PCA

通过进一步重新定义数据库，排除苯基、全氟、氰基、短链烷基色谱柱和聚乙二醇色谱柱，得到图3所示的PC1 - PC2得分图。

通过比较同一厂家生产的Hypersil C18、Hypersil BDS C18和HyPURITY C18三种色谱柱的位置，可以看出硅胶基质的差异(见图3)。C18键合配体在所有情况下都是相同的，三者之间唯一的区别是硅胶的纯度。Hypersil是一种传统的a型硅胶，含有大量的金属离子杂质，与Hypersil C18材料相比，Hypersil BDS使用的是酸洗硅胶，大大减少了金属杂质。HyPURITY采用新一代高纯硅胶制备，金属污染极低。三个色谱柱的酸度为Hypersil C18＞Hypersil BDS C18＞HyPURITY C18：在Hypersil BDS C18-Hypersil C18(图4a)和HyPURITY C18-HypersilBDS C18(图4b)的贡献图中描述了这一点。

图3， PC1和PC2的色谱柱得分图不包括非硅胶、氨基、苯基、全氟、氰基和PEG相。不同硅胶纯度的HyPURITY C18、Hypersil BDS C18和Hypersil C18在亲水碱性化合物中的分析比较(分析物结构见表1，实验部分见LC条件项下)。碱性物质1、2和4不可逆地保留在Hypersil C18上。

图4：(a) Hypersil BDS C18对Hypersil C18色谱柱的PC贡献图。(b) HyPURITY C18对Hypersil BDS C18色谱柱的PC贡献图。

结果表明，与传统的Hypersil材料相比，BDS和HyPURITY填料的酸性离子交换能力aB/P pH 2.7明显更低。这反映在它们分析五种亲水性碱性化合物的色谱性能上(见图3)。苯酚(化合物6)被包括在测试混合物中，以评估色谱柱的填充效能。五种碱性化合物的峰对称性反映了酸性离子交换能力和三种色谱柱的金属含量。

高纯度材料(HyPURITY)获得了最佳峰形，如使是酸洗BDS材料也比传统的Hypersil有了巨大的改进；然而，在BDS色谱柱上仍然观察到轻微的峰拖尾。有趣的是，这些碱基(尼古丁、苄胺和普鲁卡因胺；化合物1、2和4)如使在pH为2.7时，由于与电离的硅醇基团过度相互作用，在Hypersil色谱柱上有很强的吸附作用，因此没有被洗脱。

3.5表征程序的稳健性

由两名不同的分析师在两种不同类型的LC系统上分析了三个不同批次的Prodigy ODS3(见表3)。

从C18和C8色谱柱的PC1-PC2得分图(图5a)可以看出，结果相似，表明该方法的总体稳健；然而，图5a的扩展(见图5b)强调了两个位点的结果是两个不同的分组。在检查贡献图(图未展示)时，很明显，主要差异归因于戊苯的保留系数和疏水性选择项(aCH2)。明显的位点差异可能是由于两个位点流动相混合的准确性不同，因为位点L使用的是四元泵，而位点C使用的是二元泵。

图5，(a) C8和C18色谱柱的PC1-PC2得分图。(b) PC1和PC2得分图扩展，以突出四个Prodigy ODS3色谱柱的批间变异性和实验室间变异性。

通过实验设计进行的稳健性测试强调，色谱柱表征程序在以下实验约束条件下是稳健性的：MeOH±1% (v/v)，温度±2℃， pH±0.1单位和缓冲液浓度±2 mM。

3.6 C8与C18色谱柱比较

对图5进一步分析表明，C8 (柱号为131、53、119、31、18、67、44和混合烷基色谱柱60)被组合在一起，并在PC1-PC2载荷图中进行了表征(见图6)，C8表现出低保留率和低的形状选择性。

图6，C8和C18色谱柱的PC1-PC2载荷图。

在PCA的贡献图中，可以清楚地看到C8和C18色谱柱之间的差异，这些固定相相连接到相同的硅胶基质上，如HyPURITY (第44和42号色谱柱)、Nucleosil HD (第67和65号色谱柱)、Genesis(第31和30号色谱柱)和Discovery(第18和16号色谱柱)，这表明C18除了表现出更大的形状选择性外，还具有更强的保留性(见图7中的典型例子)。

图7，HyPURITY C18对HyPURITY C8的PC贡献图。

3.7 C18色谱柱 (基于非酸性硅胶基质)的PCA

从制造商的文献中，基于非酸性硅胶基质的C18色谱柱似乎是相似的色谱柱(见图8a，b)，这与作者的结果显现出巨大的差异。将PC1-PC2得分图与PC1-PC2载荷图结合使用，可以根据六个参数的差异选择多个不同的C18色谱柱进行评估。例如，如果从PCA图的四个扇区中选择选定的色谱柱，则可以利用色谱柱选择性的差异。PC贡献图中，Grom-Sil ODS-7 pH (柱号:36， PC1和PC2正向)，Nucleosil C18(柱号:64， PC1负向和PC2正向) ， μBondapak C18(柱号:111，PC1和PC2负向)， Luna C18(列号:55，PC1正向和PC2负向)与子集中平均柱的对比清楚地突出了色谱柱色谱特征的差异(见图8c)。Grom-Sil ODS-7 pH由于其聚合涂层、高表面积(510 m2/g)和22%的碳载量而表现出高保留，Nucleosil C18在pH 7.6时具有较高的离子交换能力，μBondapak C18具有低保留和高离子交换能力，这可能是由于其10%的低碳载量和中等表面覆盖率(330 m2/g)， Luna C18表现出低形状选择性和低离子交换能力。

图8，(a)非酸性(B型)C18的PCl-PC2得分图。(b)非酸性(B型)C18的PCl和PC2载荷图。(c) Nucleosil、Grom-Sil ODS pH、μBondapak C18和Luna C18色谱柱对于平均非酸性硅胶基质的C18色谱柱PC贡献图。

3.8极性嵌入、增强极性选择性和“Aqua”色谱柱的PCA

近年来，市面上出现了越来越多的色谱柱，这些色谱柱被归类为极性嵌入、增强极性选择性和“Aqua”型；如那些适合在高比例水相条件下进行色谱分析的色谱柱。根据所采用的键合技术，后两者有时被归类为极性/亲水性封端色谱柱。不过，公开文献中很少有关于所采用的配体键合/化合物的确切性质的细节。极性分析物在高比例水相条件下的保留可以通过多种方法实现，包括使用非端封色谱柱、短链烷基色谱柱、亲水/极性端封色谱柱和极性增强色谱柱、极性嵌入色谱柱、长链烷基色谱柱和宽孔径色谱柱。为了对这些市售色谱柱的选择进行表征，并评估它们在制药环境中的潜在用途，作者对包含31个色谱柱的数据库子集进行了PCA，这些色谱柱被制造商分类为适合用于高比例水相的色谱柱(见表4)。表4显示，由于这些信息在本质上被归类为专利信息，因此制造商缺乏关于极性嵌入部分或亲水性键的确切性质的数据。

这31个色谱柱的子集的PC1-PC2得分图将它们分为三个不同的组:(1)那些具有增强的形状选择性和减少保留的色谱柱(见图9a，b)，以极性色谱柱为代表(具有极性功能，如酰胺，脲，氨基甲酸酯和醚部分，插入到靠近硅胶表面的烷基配体中)；(2和3)“Aqua”和增强极性选择性色谱柱，具有更大的保留力，更低的形状选择性，在某些情况下，可增强氢键能力。

图9，(a)极性嵌入、极性选择性增强和“Aqua”色谱柱以及“’Aqua”色谱柱延伸分析的PC1-PC2得分图。(b)极性嵌入、增强极性选择性和”Aqua”色谱柱的PC1和P2载荷

PCA贡献图（见图10）显示，酰胺基极性嵌入色谱柱相对与混合烷基色谱柱(以Polaris Amide C18为代表，柱号76和Genesis AQ，柱号29)强调了酰胺色谱柱具有低酸性硅醇活性和大大增强形状选择性的事实。

图10，Polaris Amide C18对Genesis AQ色谱柱的PC贡献图。

极性嵌入色谱柱可以在pH为2.7时对碱性分析物进行出色的色谱分析(见图11a，b)，因为它们的烷基配体内含有极性功能团，如酰胺(如Advance， Discovery RP amide和Zorbax RP Bonus，柱号为46，22和124)，未确定的极性嵌入基团(如Prism色谱柱，柱号为80和81)，氨基甲酸酯(Symmetry Shield RP C18和C8以及XTerra RP18，柱号为102，103和116)和醚键(如Polaris醚，柱号为78和79)。比如Advance and Polaris Amide C18-两种酰胺键合色谱柱上色谱图呈高斯峰形状和较低的保留。

图11，极性嵌入、增强极性选择性和Aqua色谱柱在亲水性碱性化合物分析中的比较。分析物结构和LC条件见章节2和表1.

相比之下，其他色谱柱似乎有两种类型:具有增强极性选择性的色谱柱和所谓的”Aqua”色谱柱。前者以Platinum C18 EPS、Zorbax SB Aq相和Aquasil色谱柱(柱号为75、134和5)为代表，它们在氢键能力试验中，相比苯酚，对咖啡因表现出更强的保留。这表明具有增强极性选择性的色谱柱具有高密度的氢键作用，可能是由于极性封端或低键合密度，如Platinum C18 EPS的情况。这些色谱柱似乎不适合分析亲水性碱性化合物，因为观察到过多的分析物保留和峰展宽，特别是尼古丁和普鲁卡因胺。这与许多“Aqua”色谱柱形成鲜明对比，后者对亲水性碱性化合物表现出良好的峰形(见图11a，b)。

增强极性选择性色谱柱相对于混合烷基色谱柱(分别以Platinum C18 EPS为代表，柱号75和HiChrom RPB为代表，柱号37)的PCA贡献图(见图12a)，强调了这样一个事实，即与混合烷基色谱柱相比，增强极性选择性色谱柱具有低保留，高氢键和离子交换能力以及增强的形状选择性。

图12，Platinum C18 EPS对Hichrom RPB色谱柱的PC贡献图。

Genesis Aq和MetaSil Basi色谱柱的制造商声称，这两种色谱柱都可以在100%水相中使用，因为它们具有混合链长的烷基配体，可以防止在高水条件下发生固定相塌陷。这一亚类中的其他所谓的“Aqua”可能具有类似的防止色谱柱塌陷的方法。

值得注意的是，Prontosil C18 Aq (柱号为:84)显示了增强的极性选择性(极性封端)和混合烷基色谱柱的性质。这在亲水性碱性化合物试验的分析中得到了最显著的证明，其中观察到尼古丁和普罗卡因胺的保留和峰拖尾增加，但不像Platinum C18 EPS和Zorbax SB Aq色谱柱那样明显(柱号75和134，分别见图11b和图13)。

图13，分析亲水性碱性化合物的Aqua色谱柱比较。分析物的LC条件和结构见第2节和表1。

3.9 增强极性选择性和“Aqua”型色谱柱的PCA

从数据库中删除极性嵌入色谱柱使不同类型的“Aqua”色谱柱和增强极性选择性色谱柱之间的差异和相似性得到实现。PC1-PC2得分图(图14a，b)清楚地区分了那些保留咖啡因比苯酚更强的色谱柱(即极性选择性增强的色谱柱，如Platinum C18 EPS、Synergi RP-Polar、Zorbax SB Aq、Aquasil (柱号为75、105、134、5))和那些根据分析物的亲脂性保留化合物的色谱柱。极性选择性增强的色谱柱归功于极性封端功能团的引入(即Aquasil和Synergi RP-Polar，分别为第105和5号柱)，低表面覆盖率(Platinum C18 EPS，柱号:75)或键合技术中使用的硅烷化试剂的类型(Zorbax SB-Aq，柱号134)。

图14， Aqua色谱柱的PC1-PC2得分图和载荷图。

通过比较Platinum C18 EPS、Synergi RP-Polar、Zorbax SB Aq和Aquasil (柱号为75、105、134、5)对亲水性碱性化合物分析的选择性，进一步突出了它们的选择性增强。这些色谱柱对尼古丁和普鲁卡因胺表现出更强的保留和较差的峰形(见图13a)。相比之下，其他色谱柱如Ace Aqua、Genesis Aq和MetaSil Basic(见图13b和11a)表现出与新一代C18色谱柱相似的选择性，例如可见图3。

观察到增强极性选择性型色谱柱的色谱特征与Hypersil CEC Basic色谱柱非常相似（柱号135)。该色谱柱已被用于毛细管色谱中碱性分析物的分析，它可能是通过所采用的键合技术使色谱柱上存在高密度非酸性硅醇基产生增强电渗流。当这个色谱柱被添加到子集中时，它位于增强极性选择性色谱柱的区域，这有力地证明了这些色谱柱确实非常相似(见图15a，b)。此外，Hypersil CEC Basic色谱柱对尼古丁和普鲁卡因胺表现出较强的保留和较差的峰形(见图16)。

图15，Aqua色谱柱以及Hypersil CEC Basic的PC1-PC2得分图和载荷图。

图16， Hypersil CEC Basic C18对亲水性碱性化合物的色谱性能。分析物的LC条件和结构见第2节和表1。

在高度含水环境下对这些色谱柱进行评估时(此处未给出结果)，在将色谱柱置于60℃且流动相仅含3.3%（v/v）甲醇且流动相pH为2.7的条件下4h，未观察到色谱柱坍塌。

3.10色谱柱数据库及其应用

3.10.1等效色谱柱识别

色谱柱特征参数数据库的优点之一是能够明确地识别具有等效性质的色谱柱(即具有相同的选择性和保留能力，例如Nucleosil和Selectosil色谱柱{分别为柱编号64和88}，见图8a和图17)；这可以通过定位PCA得分图中彼此靠近的色谱柱来实现。另一种方法是计算目标的色谱柱与数据库中其他色谱柱之间的六维变量空间中的距离。

图17，用于识别等效色谱柱的Excel电子表格。Nucleosil C18被证明是Selectosil C18色谱柱的有用替代品。

这可以在电子表格程序(例如微软Excel)中实现，如下:

(1) 所有变量均通过减去该变量的平均值并除以其标准差来 “消除量纲”。

(2)计算目标色谱柱与数据库中所有其他色谱柱的“消除量纲”变量之间的差值。

(3)利用这些差异，通过毕达哥拉斯定理计算目标的色谱柱与其他色谱柱之间的距离。

(4)通过对这些距离进行排序或排序，就有可能识别出数据库中最相似或最不相似的色谱柱。参见图17的Excel电子表格的一个例子，用于找到Selectosil C18的等效柱。可以观察到，与Selectosil C18最相似的相是Nucleosil C18(这与PCA得到的结果相同，见图8a)。

有人建议，RPLC色谱柱可以分为不同的类别，以便能够识别具有等效性质的色谱柱，以适用于某些药典方法。不幸的是，许多可以在得分图中识别的分组没有很好的转化方法，并且组内的距离通常大于组间的距离。因此，许多标准C18色谱柱之间的差异大于某些C18和C8色谱柱之间或某些C18与极性嵌入/极性封端色谱柱之间的差异!因此，很难定义等效色谱柱。最有效的方法是为特定方法定义一个合适的色谱柱，然后使用该色谱柱的数据来识别具有上述等效性质的其他色谱柱。

3.10.2 合理选择色谱柱进行方法开发

表征色谱柱的第二个原因是识别那些具有不同选择性的，可以在方法开发中利用的色谱柱。很明显，苯基柱与C18色谱柱具有不同的选择性。然而，如果没有色谱柱表征的帮助，定位具有不同选择性的C18色谱柱或多或少是不可能的。柱表征与PCA相结合是鉴别不同选择性色谱柱的有效工具。通过结合得分图和载荷图中的信息，还可以确定具有不利因素的色谱柱，例如，具有高密度酸性硅烷醇基团的色谱柱，对碱性化合物的分析不利。

作者发现一种既强大又合理的方法开发策略，即通过在选定的色谱柱上运行两个缓慢的梯度来自动筛选具有不同选择性的色谱柱。随后通过计算机优化软件预测最佳等度或梯度条件，用于保留时间和峰宽建模。为了进行峰识别，建议同时使用DAD和MS检测。

3.10.3加深了对保留机制的理解

由于缺乏来自特定制造商的关于色谱柱填料的详细(有时是基本)信息，因此很难对保留机制做出推断。因此，进行色谱柱表征的第三个原因是纠正上述问题，并了解更多关于色谱柱化学的知识。通常可以根据分数和载荷图(参见之前关于极性封端色谱柱和极性嵌入色谱柱的讨论)以及分析物与色谱柱相互作用，对填充材料的官能团做出合格的推断。

04

结论

本文描述了使用已建立的测试方案建立一个独立和无偏的柱表征数据库，该数据库包含135种不同的色谱柱材料(即C18，C8，短烷基配体，氰基，苯基，极性嵌入，增强极性选择性色谱柱，“Aqua”色谱柱-极性封端和混合烷基色谱柱，全氟色谱柱加上许多新型色谱柱化学物质，包括非硅胶基质)。对色谱柱表面覆盖率、疏水选择性、形状选择性、氢键能力和在pH值为2.7和7.6时的离子交换能力进行了色谱表征。采用PCA对色谱柱及其色谱参数进行了分析，以便:(1)确定等效色谱柱；(2)选择具有广泛不同特征的色谱柱，以充分利用方法开发中的选择性差异；(3)协助合理选择合适的色谱柱；(4)提供对保留机制的更好理解，并允许对制造商所使用的官能团和键合化学物质进行合格的推断。后者是最可取的，因为作者日常使用的大多数色谱柱的性质几乎没有可靠的数据。

前期在主要包含C18和C8的较小数据库上的PCA表明，在pH 7.6下，表面覆盖率和疏水选择性之间以及氢键能力和离子交换能力之间存在相关性(因此其中一些参数变得冗余)；然而，有了这个新的和扩大的数据库，其中包含了许多不同的色谱柱化学物质，作者在PCA中包括了所有的柱参数，因为这些推导随后被证明不适用于这些不同的色谱柱化学物质。

使用简化析因设计评估了柱表征测试程序的稳健性，并在以下实验条件下被认为是可接受的: MeOH±1% (v/v)，温度±2℃， pH±0.1单位和缓冲液浓度±2 mM。

PCA在使用如此大量的数据(135*6=810个值)简化“数据挖掘”过程方面已被证明是非常有用的。PCA提供了数据库中色谱柱的简单图形比较，例如，硅胶基质反相填料的PCA，使用第一、第二和第三成分，允许将色谱柱分为非C18色谱柱、酸性色谱柱、新一代色谱柱、极性嵌入色谱柱、氰基柱、全氟苯基柱和高保留色谱柱。这三种组分描述了这些色谱柱之间近80%的总色谱差异。

PCA显示，C8和C18色谱柱与亲水性碱性化合物的峰形似乎有很好的相关性。

通过对数据库子集的分析，PCA的判别能力很强，该数据库仅包含基于非酸性硅胶基质的C18色谱柱。结果与从制造商文献中出现的C18色谱柱类似的结论有巨大差异。此外，PCA“贡献图”证明了在数据库中任何两个色谱柱之间的差异的快速可视化。

主成分分析可以区分适用于高比例水相的含有极性嵌入基团的色谱柱、含有混合烷基配体的色谱柱和含有极性/亲水端封技术的色谱柱。

作者打算维护和扩展该数据库，以包括其他和新推出的色谱柱，并扩大表征方案中使用的测试探针的范围。

阎作伟的注释

本文发表于2003年，作者所计划构建和维护的数据库目前可在ACD/AutoChrom 数据库里直接获取和使用。

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