NanoTemper Panta及Monolith助力转运体PHT1招募TASL的研究

https://doi.org/10.1038/s41467-023-41420-5

之前的细胞测定方法表明，PHT1可以运输多肽和肽聚糖等分子。为了更好的了解PHT1的转运特征，作者在体外对PHT1的底物特异性/偏好性进行检测。

PHT1为膜蛋白，溶液中含有0.02%DDM 去垢剂。膜蛋白提取量不高，并且重组表达的PHT1的糖基化严重。此外，研究中涉及到65种底物。因此，需要一种高通量的检测方法，兼容去垢剂，不受糖基化影响，并且对蛋白起始量要求低。通过nanoDSF技术进行TSA（Thermal shift assay)实验，可通过查看加入配体后靶蛋白T_m变化，快速鉴定筛选结合配体。nanoDSF技术基于蛋白内源荧光对其热变性过程中进行检测，不受糖基化修饰影响，无需染料，兼容去垢剂。蛋白样品的起始量要求低，可低至5μg/ml（以IgG为例），并且一次可完成48个样品的检测。

作者向PHT1中加入不同的底物，使用nanoDSF进行ΔT_m检测。结果显示PHT1具有相当广泛的底物特异性，并且该转运体能够结合二肽和三肽（图1）。

图1：nanoDSF筛选在5mM配体存在时PHT1的ΔT_m变化

作者通过pull down检测到PHT1和TASL之间存在相互作用。通过比较不同种类的TASL序列，发现前10个残基保守。作者设计了一个包含TASL(TASL_1-13)个残基的肽段，并利用nanoDSF和MST技术对PHT1和TASL_1-13亲和力进行了研究。

结合TASL_1-13肽对PHT1热变性过程具有的稳定作用，并且ΔT_m与结合的比例相关。用TASL_1-13滴定PHT1蛋白，并使用nanoDSF检测ΔT_m变化，测定得到表观K_D（362nM）。

图2：nanoDSF检测TASL_1-13滴定PHT1的热稳定性

此外，使用MST技术检测TASL_1-13肽和PHT1获得非常相似的K_D结果。

图3：MST检测TASL与PHT1亲和力

在这篇工作中，通过nanoDSF技术探究了PHT1和65种底物的相互作用，快速确定了其底物结合特异性和偏好性。nanoDSF技术兼容去垢剂，检测蛋白浓度宽泛，通量高，在配体筛选上具有显著优势。

此外，通过MST进行PHT1和多肽片段亲和力检测，无需固定分子，避免固定过程对膜蛋白的影响，获得准确的亲和力。

Monolith分子互作检测仪

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PR Panta蛋白稳定性分析仪

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