专业解读｜一文搞定CAR-T 细胞产品的非临床研究！FDA指南解读系列

▉ 对CAR-T细胞载体成分的非临床考虑

CAR-T细胞安全性和有效性的一个主要决定因素是用于赋予靶特异性的抗原识别域，利用的各种载体包括γ-逆转录病毒和慢病毒载体、转座子和裸mRNA。临床前评估应包括对靶抗原特异性和亲和力，评估靶向/非靶向肿瘤和非靶向毒性的可能性。表达预期靶抗原的健康/正常组织（靶向/非肿瘤）的非预期靶向性，以及健康/正常组织上表达的其他抗原的非预期靶向性，是一个安全问题，可通过体外和体内研究进行评估，推荐如下：

（1）使用具有相同抗原识别域的单克隆抗体或融合蛋白进行组织交叉反应性研究，即分析预期靶向性的功能问题；

（2）对各种器官/组织的人类原代细胞、细胞系、诱导多能干细胞衍生测试系统等进行细胞毒性测试，即分析非预期靶向性的细胞毒性测试；

（3）蛋白质阵列，即通过分析微阵列、功能微阵列和反相微阵列，分析混合物中蛋白质的结合亲和力、特异性和蛋白质表达水平；

（4）相关动物模型，即分析非预期靶向性的毒性，或体内脱靶效应。

（5）对目标抗原测定表征，即分析蛋白质的各项特性，包括结构、理化、活性等一系列内容。

FDA建议申报时包含以前有相同抗原识别域的CAR或单克隆抗体（如适用）的临床经验中的信息，这可能会减少或消除进行额外特异性和亲和力测试。确定潜在的脱靶活动对于制定入组标准和特定的输液后评估和监测计划非常重要。

此外，由于产品之间的固有差异（例如，CAR-T细胞运输、扩增、产生细胞因子、诱导细胞毒性和持久性的能力），利用相同单链可变片段（scFv）的CAR-T细胞和单克隆抗体的安全性可能不同。

多种整合到CAR-T细胞中的激活和共刺激结构域，包括CD3ζ链、4-1BB（CD137）、CD28和CD40等，这些域组合可导致不同的生物学特性。这可能会影响体内细胞扩增、持久性和其他免疫细胞类型激活的程度。解决CAR-T细胞非依赖细胞因子生长和不受控制增殖的可能性是临床前评估的另一个重要方面。

▉ 对CAR-T细胞成分的非临床考虑

用于表达CAR的各种T细胞群包括：

（1）纯化的T细胞亚群；

（2）含有其他污染细胞（如NK细胞、B细胞等）的未选择T细胞池；

（3）病毒抗原特异性T细胞（例如巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV））；

（4）选择干细胞样或“年轻”T细胞。

因此，临床前评估可能包括检测细胞因子非依赖性细胞生长、体外和体内T细胞克隆性测试、核型分析、TCR谱分析，以及通过体外刺激和识别检测对病毒抗原的特异性。

▉ CAR-T细胞的体内试验

动物模型可用于CAR-T细胞功能的验证。CAR-T细胞和肿瘤靶点的物种特异性、异种移植物抗宿主反应等存在一些局限性，但在小鼠异种移植模型（即，使用人类CAR-T细胞的人类肿瘤异种移植小鼠模型）中进行的体内试验可以提供有关CAR-T细胞的运输和增殖特征的信息。

图1：患者来源的异种移植小鼠用于CAR T细胞评估，文献：Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies[J]. Cancers, 2020, 12(7)

如果有相关的替代产品可用，同基因肿瘤动物模型可以提供有关替代CAR-T细胞与完整宿主免疫系统相互作用的信息，以及潜在的靶向/非靶向肿瘤毒性。应提供数据以支持模型的适用性，例如抗原识别域对人类靶点与动物靶点的结合亲和力，以及所评估物种中靶抗原的表达谱。

▉ 经额外修改的CAR-T细胞

CAR-T细胞可以在转基因中包含其他成分，如自杀基因、检测/选择基因或免疫调节元件等。例如，混合淋巴细胞反应可能有助于评估经修饰以降低GVHD风险的产品的免疫原性和对同种异体产品的免疫反应。当加入自杀基因时，FDA建议进行临床前研究，确定对诱导CAR-T细胞耗竭至关重要的任何额外药物或生物制剂的剂量。

CAR-T细胞安全和活性的参数是多因素的，包括：

（1）载体结构的设计（例如，抗原识别结构域、信号结构域、跨膜结构域和铰链结构域），引入的外源基因种类、数量、长度越少越好；

（2）载体传递方法，病毒类载体元件涉及的越少越好；

（3）细胞来源，背景越明确越好；

（4）操作过程（例如激活、细胞选择），人员操作越少越好；

（5）生物活性（例如，细胞因子表达谱、细胞毒性、增殖），数据越全越好；

（6）添加新成分（如自杀基因、免疫调节元件），背景和数据越全越好。

NMPA于2021年11月颁布的《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》对基因修饰细胞治疗产品非临床有效性和概念验证、药代动力学、转基因表达产物和插入突变风险评估做了论述，强调了免疫细胞应尽可能采用多种方法评估其靶点相关毒性和脱靶毒性风险。

▉ 微谱生物科技

微谱生物科技一直致力于为生物药客户提供专业的生物安全、质量研究与GMP验证服务。我们已取得BSL-2实验室认证，并先后荣获ISO9001、CMA、CNAS等资质认可与认证。以中外申报为标准，我们持续建立高质量服务体系，为客户打磨定制化的研究方案。

针对CAR-T细胞产品在非临床阶段的开发，微谱生物科技可以提供的服务有：