天美讲堂丨样品基底对拉曼光谱的影响

2024-01-16 10:36:16 天美仪拓实验室设备（上海）有限公司

要点

● 在拉曼测试中，样品基底会对拉曼光谱产生影响，可能掩盖有价值的样品信息。

● 不同的基底材料具有独特的光学性质，并以不同的方式影响拉曼光谱。

● 本文研究了玻璃、石英、氟化钙和不锈钢作为基底的影响，以帮助您最大限度地提高拉曼数据质量。

在拉曼光谱的测试中，有许多参数需要考虑才能获得高质量的数据。其中一个经常被忽视的是放置样品的基底，如图1所示。有多种基底材料可用，并且每种材料对拉曼光谱的测试会产生不同的影响。在设计实验时，必须了解基底的拉曼特性，以确保其产生的光谱不会掩盖有关样品感兴趣的信息。¹本文将讨论拉曼光谱测试中常用的四种不同基底（玻璃、石英、氟化钙和不锈钢）的特性。

图1. 样品的基底

基底1：玻璃

最常见、低成本的基底是玻璃，可以相对便宜地大量购买。玻璃载玻片是透明的，可用于反射和透射照明的宽场显微镜。然而，使用玻璃进行拉曼光谱测试的一个显著缺点是光致发光（PL）背底。当使用标准激光波长时，它会掩盖有价值的光谱信息。²图2显示了玻璃基底在使用三种不同激光获得光谱时的影响，这些激光跨越了电磁（EM）光谱的可见光和近红外（NIR）区域。

图2. 使用532nm、638nm和785nm激光器对玻璃进行拉曼分析

当用785nm激光（红色）分析时，玻璃在约为1400 cm^-1处显示出强的PL峰。当放置的样品是透明的或者当样品用玻璃盖玻片覆盖时，可能观察到这一峰值。使用638nm（绿色）时，玻璃的光谱显示拉曼特征和上升的PL峰的组合。使用532nm（蓝色）时没有PL峰。但玻璃的拉曼光谱仍然相对复杂，并且它在与许多感兴趣的潜在官能团相同的光谱范围中包含多个宽峰。可以通过用铝箔覆盖玻璃来避免这些不必要的影响。然而，当使用低工作距离物镜时，这是不合适的，因为很难以所需的精度水平来固定它。最好的方法是使用玻璃的替代材料。

基底2：石英

熔融石英是一种可用于拉曼光谱测试的替代透明基底。当用不同的激光波长测试时，石英产生的光谱比玻璃的变化更小。图3显示，石英不表现出PL峰，这一点明显优于玻璃。较大的光谱图采取与上述玻璃光谱相同的波数范围，插图更详细地显示了石英的振动特征。与其它可用的基底相比，拉曼光谱仍然很复杂，但最突出的波段是在低波数区域，该区域不太可能与感兴趣的振动模式重叠。石英是高温拉曼应用中的首选基底，因为它非常耐热。

图3. 使用532nm、638nm和785nm激光器对石英进行拉曼分析

基底3：氟化钙

氟化钙（CaF₂）是另一种透明材料，通常被认为是拉曼显微镜基底的“黄金标准”。对于大多数拉曼显微镜应用，CaF₂具有比玻璃和石英更有利的光学性质。为了说明这一点，图4中绘制了用不同波长获得的CaF₂的光谱图。CaF₂没有表现出PL峰，类似于石英。CaF₂的优点是它只有一个狭窄的拉曼峰，约330 cm^-1，这是大多数官能团不会振动的波段。与玻璃和石英更复杂的光谱相比，该波段不太可能掩盖样品特征。

图4. 使用532nm、638nm和785nm激光器对氟化钙进行拉曼分析

基底4：不锈钢

不锈钢载玻片是前面讨论的基底的不透明替代品，具有最小的背景干扰并且没有拉曼光谱特征。如图5所示，不锈钢显示出比上述任何材料都少的拉曼信号和可忽略的背景干扰，使其成为拉曼显微镜应用的优质基底。

图5. 使用532nm、638nm和785nm激光器对不锈钢进行拉曼分析

不锈钢对白光是不透明的，因此样品观察仅限于反射照明显微镜。与其它透明材料相比，不锈钢可以增强拉曼强度，因为金属表面的反射可使激光束两次通过样品。3为了证明这一点，对玻璃和不锈钢上的单个3μm聚苯乙烯珠进行了分析，如图6所示。在相同的激光和散射路径条件下，与玻璃（绿色）相比，当聚苯乙烯珠在不锈钢基底（蓝色）上时，检测到的拉曼强度显著提高。

图6. 不锈钢和玻璃基底上聚苯乙烯珠的拉曼分析

结论

在本文中，我们讨论了用于拉曼光谱测试的各种样品基底的影响，总结见下表。需要注意的是，石英、氟化钙和不锈钢比玻璃更贵，但它们也可以通过清洗、消毒进行重复使用。通过了解不同基底的性质，进而选择合适的基底，并确保测试所得光谱仅来自样品感兴趣的部分。

参考文献

1.J. Butler et al., Using Raman spectroscopy to characterise biological materials, Nat. Protoc., 2016, 11, 684-687.

2.J. Byrne et al., Raman Microscopy: Complement or Competitor?, in RSC Analytical Spectroscopy Series, ed. D. Moss, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2010, 105-143.

3.T. Lewis et al., Mirrored stainless steel substrate provides improved signal for Raman spectroscopy of tissue and cells, J. Raman Spectrosc., 2017, 48, 119-125.