药物分析方法开发梯度洗脱问题

梯度洗脱出现的问题

梯度洗脱中所出现的故障与等度洗脱非常类似,主要包括以下方 面：第一是与仪器故障实验技术、色谱柱故障等有关；第二是由于试验条件不当设置导致分离方面问题(分离度差、宽峰等）。下表汇总了梯度洗脱常见故障及解决方法。

1）基线漂移 如果B溶剂（甲醇）比A溶剂（水）吸收大，梯度洗脱时基线上升，在低紫外波长检测更加厉害。一个解决的办法是加有紫外吸收的组分到A或B溶剂中，以均衡两种溶剂的吸收。加紫外吸收剂的一个要求是在梯度洗脱条件下无保留。也可加氧化亚氮在A(水）中。在185nm〜200nm 处检测常加低浓度的硝酸盐；在高检测波长加周期表中高族的盐（如溴酸盐、 高碘酸盐）。

2）伪峰 在流动相中存在有紫外吸收的杂质，用梯度洗脱能分离出来，即不进相关的样品也照常出峰。如用普通的蒸馏水或含有杂质的溶剂就会不断出峰或基线漂移，建议用HPLC级的水和溶剂。

3）溶剂分层 在梯度洗脱中用硅胶柱最易出现这种现象。若B溶剂活性很强（如丙醇），A溶剂极性很弱（如正己烷）。在梯度初始阶段B溶剂被柱所吸收，继续梯度B溶剂就打破平衡。可能在色谱图上某些点分离度明显降低，个别峰特别窄，而两侧峰又比较宽。在窄峰这一点上，正好B溶剂破坏了平衡，然后又分层。分析时要注意选用对B溶剂吸收低的柱，用键合相的柱很少发生这种现象。

溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一 定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液 混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

梯度滞后体积

梯度滞后体积是指从溶剂配比完成点到色谱柱头的系统体积，也可称为延缓体积，相当于在梯度运行之前运行一段等度条件。

滞后体积的差异是造成梯度重现性差和方法传递困难的根源之一。系统体积较大时，由于梯度的谱带展宽作用，会改变预期的梯度形状，使得不同HPLC系统之间难以进行方法转换。

传统HPLC系统滞后体积一般在0.5mL〜5mL范围，通常采用4.6mm内 径，150mm或更长的色谱柱，分析时间10min〜20min之间或更长时，滞后体积的影响并不显著。但是随着柱长变短、内径变细，较大的滞后体积可能会引起保留时间明显增加，色谱分离情况发生变化，因此，当用细内径色谱柱进行分离时，滞后体积太大会引起梯度变化的延迟。