药物分析方法开发梯度洗脱问题

2023-12-21 13:39:16, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司


药物分析方法开发梯度洗脱问题

梯度洗脱出现的问题

梯度洗脱中所出现的故障与等度洗脱非常类似,主要包括以下方 面:第一是与仪器故障实验技术、色谱柱故障等有关;第二是由于试验条件不当设置导致分离方面问题(分离度差、宽峰等)。下表汇总了梯度洗脱常见故障及解决方法。

1)基线漂移 如果B溶剂(甲醇)比A溶剂(水)吸收大,梯度洗脱时基线上升,在低紫外波长检测更加厉害。一个解决的办法是加有紫外吸收的组分到A或B溶剂中,以均衡两种溶剂的吸收。加紫外吸收剂的一个要求是在梯度洗脱条件下无保留。也可加氧化亚氮在A(水)中。在185nm〜200nm 处检测常加低浓度的硝酸盐;在高检测波长加周期表中高族的盐(如溴酸盐、 高碘酸盐)。

2)伪峰 在流动相中存在有紫外吸收的杂质,用梯度洗脱能分离出来,即不进相关的样品也照常出峰。如用普通的蒸馏水或含有杂质的溶剂就会不断出峰或基线漂移,建议用HPLC级的水和溶剂。

3)溶剂分层 在梯度洗脱中用硅胶柱最易出现这种现象。若B溶剂活性很强(如丙醇),A溶剂极性很弱(如正己烷)。在梯度初始阶段B溶剂被柱所吸收,继续梯度B溶剂就打破平衡。可能在色谱图上某些点分离度明显降低,个别峰特别窄,而两侧峰又比较宽。在窄峰这一点上,正好B溶剂破坏了平衡,然后又分层。分析时要注意选用对B溶剂吸收低的柱,用键合相的柱很少发生这种现象。

溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相,有些溶剂在一 定比例内混溶,超出范围就不互溶,使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液 混合时,还可能析出盐的晶体,尤其使用磷酸盐时需特别小心。

梯度滞后体积

梯度滞后体积是指从溶剂配比完成点到色谱柱头的系统体积,也可称为延缓体积,相当于在梯度运行之前运行一段等度条件。

滞后体积的差异是造成梯度重现性差和方法传递困难的根源之一。系统体积较大时,由于梯度的谱带展宽作用,会改变预期的梯度形状,使得不同HPLC系统之间难以进行方法转换。

传统HPLC系统滞后体积一般在0.5mL〜5mL范围,通常采用4.6mm内 径,150mm或更长的色谱柱,分析时间10min〜20min之间或更长时,滞后体积的影响并不显著。但是随着柱长变短、内径变细,较大的滞后体积可能会引起保留时间明显增加,色谱分离情况发生变化,因此,当用细内径色谱柱进行分离时,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟。


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